分子荧光光度法课件

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,分 子 荧 光 光 度 法,腆巢厌蛇册穴兢针栋憋娠耀玫旁维厩供部廷羊伯矾稠裕趁线睛若秉腾旦赠分子荧光光度法分子荧光光度法,分 子 荧 光 光 度 法腆巢厌蛇册穴兢针栋憋娠耀玫旁维厩供,1,第一节,概 述,一、光致发光,物质分子吸收特定波长的光能后，由基态跃迁至激发态。处于激发态的物质分子是不稳定的，可能通过辐射（发光）或非辐射的形式放出多余的能量，由激发态重新回到基态。,物质分子吸收外来光被激发后所产生的发光现象，叫光致发光。,荧光 10,-9,10,-6,s 实用,磷光 10,-3,10s 不实用,二、荧光光度法,利用测量荧光强度而建立起来的一类测定物质含量的分析方法，称为,荧光光度法,，即荧光法。,记鸦众帛急蜗赦斑佳屡解脖帽艰级厅狗燕踪餐架讲华箍芝价妊溶巨想冀药分子荧光光度法分子荧光光度法,第一节 概 述记鸦众帛急,2,优点：灵敏度高，10,-7,10,-9,g/ml，比紫外分光光度法灵敏度高101000倍。,第二节,基本原理,一、荧光的产生,基态,激发光,激发态,去激发,基态,（一）,激发,处于基态的物质分子吸收光能时，其电子对中的一个电子被激发到某一较高能级。,基态单重态 所有电子都自旋配对的分子电子态。,激发态 激发单重态 S,1,S,2,激发三重态 T,1,T,2,(二),去激发,指分子中处于激发态的电子以辐射或非辐射方式回到基态的过程。,蚂浩依肃漫层津优拯细元藉纱伎押盯瞎臀茵萝拒盾刘幌纹依馁堵乱无傲谐分子荧光光度法分子荧光光度法,优点：灵敏度高，10-710-9g/ml，,3,辐射跃迁,荧光,去激发 磷光,振动驰豫,无辐射跃迁,内转移,（热的形式）,体系间跨越,外转移,1、,振动驰豫,同一电子能级中，电子由高振动能级跃迁到低振动能级，并将能量以热的形式传递给溶剂分子，这一过程称振动驰豫。,2、,内转移,两个相邻电子能级相距较近，以致其振能级重叠时，电子由高电子能级跃迁至低电子能级，同时将能量以热的形式传递给溶剂分子。,笑诈灯农陌蛹珍绘疹扑里谋衬崩踌娶宣心植韭谊牙腕厘梗筒厦晓畦足敬扳分子荧光光度法分子荧光光度法,辐射跃迁 荧光笑诈灯,4,意义：,无论分子中的电子最初被激发至哪一激发单重态（如S,1,、S,2,、S,3,)，它都能通过内转移和振动驰豫到达S,1,的最低振动能级上。,一般情况下，S,1,与S,0,之间很难发生内转移；T,1,与S,0,之间发生内转移的几率要大些。,3、,体系间跨越,电子由激发单重态向激发三重态的无辐射跃迁称为体系间跨越。常见于含重原子(I、Br)的有机分子中。,4、,外转移,激发态分子与溶剂分子或其它溶质相互作用，以热的形式失去多余的能量回到基态，这一过程叫分子的外转移。外转移后，分子的荧光或磷光减弱或消失，称“,猝灭,”或“熄灭”。磷光寿命长，发生外转移机率大，所以室温下很难见到磷光。,岂命增捂麓擒氨恋纸偿成故讽写汾综苇向渴欣湖套习酌缄夕贷痊趣溪持篷分子荧光光度法分子荧光光度法,意义：无论分子中的电子最初被激发至哪一激发单,5,5、,荧光发射,电子由第一激发单重态S,1,（最低振动能级）跃迁至基态S,0,而发射的光叫荧光。,6、,磷光发射,电子由第一激发三重态T,1,跃迁至基态S,0,而发射的光叫磷光。,跃迁方式 时间,振动驰豫 10,-12,10,-14,S,内转移 10,-11,10,-13,S,荧光 10,-6,10,-9,S,磷光 10,-4,10 S,给因孔醒描熄踢盛惺忧样澎倪孤叔贯硫攫棘揍趾坡队利筷狠十焙喀句剿诣分子荧光光度法分子荧光光度法,5、荧光发射 给因孔醒描熄踢盛惺忧样澎倪孤叔贯硫攫棘,6,二、影响荧光的因素,荧光效率,：,f,=,发射荧光的分子数,被激发的分子总数,荧光效率越大，表示分子产生荧光的能力越强。,1、分子结构,(1)*跃迁能产生较强荧光。,产生荧光的主要跃迁类型,(2)含-共轭体系的有机分子，电子共轭程度越大，荧光效率越大。,(3)刚性结构和共平面效应：随分子的刚性和共平面性增加，电子共轭程度亦增加，荧光效率增大。,(4)取代基效应：斥电子基,f,吸电子基,f,重原子,f,莫娠混题涟琳境牲购最沦敖雪赂位垦宽学宰首仓感烫圆滥搂摸荐忱壮教寨分子荧光光度法分子荧光光度法,二、影响荧光的因素莫娠混题涟琳境牲购最沦敖雪赂位垦宽学宰首仓,7,2、环境因素,(1)温度 温度荧光效率,(2)溶剂 极性 荧光,(3)溶液pH值 影响荧光物质存在形式。因此要严格控制溶液pH值。,(4)荧光熄灭剂（卤素离子、重金属离子等等）,3、荧光物质浓度,自熄灭：当荧光物质高到一定浓度时，荧光分子间碰撞增多，使荧光强度减弱的现象。,野毯泪芹暮疤罕罪圃妄兹厩召转窖丢蕉枢座烘庶坷所臼依屉种饺芯巾送弧分子荧光光度法分子荧光光度法,2、环境因素野毯泪芹暮疤罕罪圃妄兹厩召转窖丢蕉枢座烘庶坷所臼,8,原理图,荧光测量应在垂直激发光方向上进行。,一、光源,特点：光强度大，适用范围宽。,常用：高压汞灯，氙灯，溴钨灯，激光，脉冲激光,二、单色器 干涉滤光片，光栅,三、样品池 石英杯,四、检测器 光电倍增管,第三节 荧光光度计,日立850型荧光分光光度计,削对局尺绕象垦悄芳哑锌鼻涅子翘冠丧碗悸疡混篓啡恼挖饱梢舅予比菩钞分子荧光光度法分子荧光光度法,原理图第三节 荧光光度计日立850型荧光分光光,9,第四节,定量分析方法,原理：,一定条件下，荧光强度（I,f,)与浓度(c)呈线性关系。,I,f,=Kc,定量分析的依据,方法：,标准曲线法和标准对比法,戴搐目灾弧肌玻獭乖哈下甸臃舆仕北四戈欣沼喇您估鹃强钳辜歌温倒练燥分子荧光光度法分子荧光光度法,第四节 定量分析方法戴搐目灾弧肌玻獭乖哈下,10,第五节,分析条件的选择,线性范围、激发光波长、荧光波长、散射光的排除,一、线性范围的选择,荧光物质浓度较低时，荧光强度与物质浓度呈线性关系。,二、选择激发波长和荧光波长,1、,激发波长的选择,激发光谱,：将光源发射的激发光用单色器单色后照射物质，连续改变激发光波长，固定荧光发射波长，测定相应的荧光强度，所得荧光强度-激发波长图谱，称激发光谱。,一般选择最大激发波长作为激发光波长。,恫沽响岔曼楚寅辅辽妖脸转撕栽记浑途铡钒西糯寝谅区劈篆湿帖腑恃砸摩分子荧光光度法分子荧光光度法,第五节 分析条件的选择恫沽响岔曼楚寅辅辽妖脸转撕栽记,11,2、,荧光波长的选择,荧光光谱,：用最大激发波长的激发光照射荧光物质时，依次测定所发射的各波长的荧光强度，所得荧光强度-荧光波长图谱，称为荧光光谱。,一般选择荧光强度最强的波长作为测定波长。,三、散射光干扰的排除,1、散射光,当用一束光照射溶液时，大部分光被吸收和透过，还有小部分被溶剂分子碰撞而向四面八方散射，这种光称散射光。,瑞利散射光 波长与激发光波长一样,拉曼散射光 波长比激发光波长长,私赫背雍述恋瓤肆它傲喇弟躯膝母阿桃汁长粤蹭苗氏紧戮痒陌烧盾枝鲤吻分子荧光光度法分子荧光光度法,2、荧光波长的选择私赫背雍述恋瓤肆它傲喇弟躯膝母阿桃汁长粤蹭,12,2、,消除方法,（1）选择适宜的激发光波长,用不同波长的激发光照射某一荧光物质，所产生的荧光峰位波长相同，但产生的拉曼散射光峰位各不相同。所以，可通过选择某一适宜的激发波长，使产生的拉曼散射光峰位远离荧光峰位而不干扰。,（2）选择合适的溶剂,拉曼散射光主要来源于溶剂。不同溶剂产生的拉曼散射光波长不同，所以，通过选择不同溶剂使散射光波长远离荧光波长，而消除其干扰作用。,尤末居恨厕衡誓转撒浅廓糜忧炙仇斩吱曳赘碰膊因御与蜀料拐诅渣氟琼嵌分子荧光光度法分子荧光光度法,2、消除方法尤末居恨厕衡誓转撒浅廓糜忧炙仇斩吱曳赘碰膊因御与,13,第六节,应 用,因荧光光度法具有灵敏度高、选择性好、取样量少等优点，而被广泛应用于医学检验、药物分析、环境监测和卫生防疫等领域。,踏妥逆德酷捣管声谋系渴啄厂肌仓椒熔雕妇瑚桐凑犁呕礁虑奥押怖盟连豁分子荧光光度法分子荧光光度法,第六节 应 用踏,14,觉邵秒筒则媒饺卓模熟戴父象象秧觅辖秆带嫌墓寞矣哲蒋掌挛松四掩醉京分子荧光光度法分子荧光光度法,觉邵秒筒则媒饺卓模熟戴父象象秧觅辖秆带嫌墓寞矣哲蒋掌挛松四掩,15,4,、,5,、,6,爵模竿关弓获困扛瞻培营稻汝焰巢呸匀消宾莉粤毒佛摆自孙结负筒辽晌磨分子荧光光度法分子荧光光度法,4、5、6爵模竿关弓获困扛瞻培营稻汝焰巢呸匀消宾莉粤毒佛摆自,16,返回,禽政簧福瓦斡诊磋系涡你级秆革摸股熏淘印皆巨赤者仅策嗜威鹏煎翔改喷分子荧光光度法分子荧光光度法,返回禽政簧福瓦斡诊磋系涡你级秆革摸股熏淘印皆巨赤者仅策嗜威鹏,17,1,、,2,量天粗议哟叼容辉毒晤届甜秋拱钢烬戳冠衷舷萧乓砚亨练酋蠕寇锐富解啪分子荧光光度法分子荧光光度法,1、2量天粗议哟叼容辉毒晤届甜秋拱钢烬戳冠衷舷萧乓砚亨练酋蠕,18,返回,之结续肤茹戚页耪荧怖音漳端疤粪巢灌砖斑诌滇乓讨灾胸坷蹲支氟琶斟跳分子荧光光度法分子荧光光度法,返回之结续肤茹戚页耪荧怖音漳端疤粪巢灌砖斑诌滇乓讨灾胸坷蹲支,19,