回顾Western-blot-实验原理和实验步骤课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,.,*,Western blotting,基本原理和实验步骤,.,1,Western blotting.1,为什么要做蛋白质印迹实验？,研究一些体外的蛋白质分子，寻找目的蛋白是否存在样品当中,蛋白质的表达情况，上调或下调表达，在不同的样品中，样品之间的表达差异性。,.,2,为什么要做蛋白质印迹实验？.2,1,Western blot,基本原理,蛋白免疫印迹的组成,Western,blot,一般流程,Western blot,常见问题分析,.,3,1Western blot 基本原理蛋白免疫印迹的组成We,1,Western Blot,基本原理,WesternBlot,采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。,SDS-PAGE,可对蛋白质样品进行分离，转移到固相载体,例如,PVDF,膜上。固相载体可以吸附蛋白质，并保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。转移后的,PVDF,膜就称为一个印迹（,blot,），用蛋白溶液（如,5%BSA,或脱脂奶粉溶液）处理，封闭,PVDF,膜上的疏水结合位点。用目标蛋白的抗体（一抗）处理,PVDF,膜,只有待研究的蛋白质才能与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，这样清洗除去未结合的一抗后，只有在目标蛋白的位置上结合着一抗。用一抗处理过的,PVDF,膜再用标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠,IgG,的抗体。处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。,.,4,1Western Blot基本原理WesternBlot采用,2,组成,蛋白免疫印迹（,Western blotting,或,Immunoblotting,）一般由凝胶电泳、样品的印迹和免疫学检测三个部分组成。,第一步,:,是做,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳，使待测样品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分成带。,第二步：把凝胶中已分成条带的蛋白质转移到一种固相支持物上，用得最多的材料是硝酸纤维素膜,(NC,膜,),和,PVDF,膜，蛋白转移的方法多用电泳转移（转移电泳），它又有半干法和湿法之分，电转移主要方法有垂直的槽式和水平的半干式两种。,第三步：是用自特异性的抗体检测出已经印迹在膜上的所要研究的相应抗原。免疫检测的方法可以是直接的和间接的。现在多用间接免疫酶标的方法，在用特异性的第一抗体杂交结合后，再用酶标的第二抗体（碱性磷酸酶（知,AP,）或辣根过氧化物酶（,HRP,）标记的抗第一抗体的抗体）杂交结合，再加酶的底物显色或者通过膜上的颜色或,X,光底片上暴光的条带来道显示抗原的存在。该技术被广泛应用于蛋白表达水平的检测中。,.,5,2组成蛋白免疫印迹（Western blotting 或 I,3,Western blot,流程图,.,6,3Western blot 流程图.6,Western Blot,一般流程,1,蛋白样品的制备,SDS,聚丙烯酰胺,凝胶电泳,转膜,封闭,一抗杂交,洗膜,二抗杂交,洗膜,底物显色,.,7,Western Blot一般流程1蛋白样品的制备转膜.,蛋白样品的制备,2,1,、细胞的处理：,1,、细胞计数，取,5,*,104/well,，,500g,离心,5min,。加入,200ul PBS,混匀，,500g,离心,5min,。去掉废液加入,15ul PBS,再加入,5ul 5Xloading,buffer,，,100C,煮沸,10min,，冰上放置,5min,，,稍,离心。,2,、分泌蛋白的提取：取,15ul,细胞上清，加入,5ul 5Xloading,buffer,，,100C,煮沸,10min,，冰上放置,5min,，,稍,离心。,.,8,蛋白样品的制备21、细胞的处理：1、细胞计数，取5*104,3,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳,.,9,3SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳.9,4,分离胶浓度与蛋白分离范围,.,10,4分离胶浓度与蛋白分离范围.10,5,制胶,1,）装好架子，固定好玻璃板。,2,）注水试漏。,3,）倒水，甩干，用滤纸吸净残留水份。,4),按照下面配方配制,12%,分离胶。一般,1.5,玻璃板需胶,6.5-7ml,，,1.0,玻璃板需胶,4.5ml,。,5),将胶慢慢倒入，防止有气泡产生。,6,）在胶上面加入一层蒸馏水，可以将胶里的气泡压出、将胶面压平并防止顶层胶风干。,7),待分离胶凝集后（至少,20,度，,30min,），配制浓缩胶,5,。,.,11,5制胶1）装好架子，固定好玻璃板。.11,6,制胶过程注意事项,操作时要使两玻璃对其，以免漏胶,加完分离胶后，加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。,灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。,操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。,分离胶充分凝固就倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。,插梳子时要使梳子保持水平。,.,12,6制胶过程注意事项操作时要使两玻璃对其，以免漏胶.,7,上样与电泳,将制备好的样品溶解后，把蛋白样品直接上样到,SDS-PAGE,胶加样孔内即可。,浓缩胶用,70V,电压，当样品至分离胶时，用,120V,电压，至溴酚兰跑到底时停止电泳。,电泳时常遇到的问题,条带呈笑脸状，原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好。,条带呈皱眉状，可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。,拖尾：样品溶解不好。,纹理（纵向条纹）：样品中含有不溶性颗粒。,条带偏斜：电极不平衡或者加样位置偏斜。,条带两边扩散：加样量过多。,.,13,7上样与电泳将制备好的样品溶解后，把蛋白样品直接上样到SD,8,转膜,在电流的作用下，使蛋白质从胶转移至固相载体（膜）上。,膜的选择：印迹中常用的固相材料有,NC,膜、,DBM,、,DDT,、尼龙膜、,PVDF,等。我们选用,PVDF,（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理强度，以及具有更好的化学兼容性。有两种规格：,Immobilon-P,（,0.45um,）和,Immobilon-PSQ(0.2um for MW20kDa),。,槽式湿转法,将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中。,-/,海绵,/,滤纸,/,胶,/,膜,/,滤纸,/,海绵,/+,.,14,8转膜在电流的作用下，使蛋白质从胶转移至固相载体（膜）上。,半干转移法,即将凝胶夹层组合放在吸有转印缓冲液的滤纸之间，通过滤纸上吸附的缓冲液传导电流，起到转移的效果。因为电流直接作用在膜胶上，所以其转移条件比较严酷，但是其转移时间短，效率高。,-/,滤纸,/,胶,/,膜,/,滤纸,/+,9,.,15,半干转移法即将凝胶夹层组合放在吸有转印缓冲液的滤纸之间，通,10,半干转移步骤,（,1,）从阳极（下）到阴极（上）方向依次：滤纸、,PVDF,膜、凝胶、滤纸，呈三明治样。在加有转膜液的盘里放入转膜用的夹子、滤纸和浸过的膜。,（,2,）将阳极（下）打开使保持水平。在上面垫,两,张,厚,滤纸，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。,（,3,）,轻轻,将小玻璃板撬掉,，再,将浓缩胶轻轻刮去，要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶，并根据胶的大小裁剪同样大小,PVDF,膜，剪去膜的,左,上角作为标记,。,如果样本多，同时做几张膜，可用铅笔在膜下角标,ABCD,或,1234,，这样可以分出膜的正反和加样顺序。,注意：裁滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。,将裁好的,PVDF,膜置于甲醇中浸,2min,才可使用。,（,4,）先把,PVDF,膜盖在,2,层滤纸并除去气泡,再,把胶盖在膜上，最后盖上另,2,张滤纸，擀几下盖上阴极盖子。整个操作在转膜液中进行，要不断的擀去气泡。,（,5,）将盒子放入转膜槽中，转膜时会产热，打开电源，设置,mA,和时间转膜时间。,.,16,10半干转移步骤（1）从阳极（下）到阴极（上）方向依次：滤,转膜条件,推荐：,25V,，,1.0A,，,25min,。（适合本实验室半干转移条件）,转膜注意事项：,滤纸、胶、膜之间不能有气泡产生,滤纸、胶、膜的大小和摆放顺序,胶和膜上要做好标记，识别正反面和上下,PVDF,膜需要,100%,甲醇预处理，后续操作中膜必须保持湿润,11,.,17,转膜条件推荐：25V，1.0A，25min。（适合本实验室,1,、,封闭是为了使我们的抗体仅仅只能跟特异的蛋白质结合而不是和膜结合。,2,、,常用的封闭液有,bovine serum albumin(BSA),，,non-fat milk,，,casein,，,gelatin,，,tween-20,等，我们一般用,non-fat milk,。,3,、,在转移结束前配好,5%,的,Milk(TBST,溶解,),。转移结束后将膜放入,milk,中,block(,一定要放在干净的容器里，避免污染而且要足以覆盖膜,),，,4C,过夜,。,4,、,封闭后可以不洗膜，让膜的一角在吸水纸上接触，把封闭液控一下即可,5,、,Tween-20,的作用：减少非特异性吸附，不影响抗体与抗原的结合。,12,封闭,.,18,1、封闭是为了使我们的抗体仅仅只能跟特异的蛋白质结合而不是和,1,、,先将需要检测的抗体准备好，并决定好它们的稀释度。,2,、,配好,1%,的,Milk(TBST,溶解,),，按要求稀释好抗体。注意，如需高比例稀释，最好采用梯度稀释。,3,、,将稀释好的抗体和膜一起,放在密闭的自封袋或抗体盒中，,100rpm,摇动孵育。一般采用,RT 1,小时。,洗,膜,用,TBST,摇动洗三次，每次,10min,。,洗涤是为了洗去一抗与抗原的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景的深浅。,12,一抗杂交,.,19,1、先将需要检测的抗体准备好，并决定好它们的稀释度。2、配,13,二抗杂交,1,、将,PVDF,膜放在密闭的自封袋或抗体盒中，加入稀释好的荧光二抗，,孵育,RT 0.5,小时。,（,一般采用,HRP,标记的二抗，稀释比例,参照说明书）,注：,二抗的稀释比例不能太低，否则容易导致非特异性的结合。,洗膜,去掉二抗稀释液，加入,TBST,液，在测摆摇床上缓慢摇动洗涤,5-10min,。吸尽洗涤液后再加入洗涤液洗涤,5-10min,。共洗涤,3,次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。,.,20,13二抗杂交1、将PVDF膜放在密闭的自封袋或抗体盒中，加入,1,、用平头镊子取出膜，放入已配制好的,BeyoECL Star,工作液中（,BeyoECL Star,工作液应提前取出放置室温）放置,1-2min,。,2,、取膜，弃去,BeyoECL Star,工作液，将膜放置在自封袋中间，随后进行凝胶成像仪发光检测。,14,底物显色：化学发光法（,ECL,）,.,21,1、用平头镊子取出膜，放入已配制好的BeyoECL Star,4,Western blot,常见问题分析,可能遇到的问题及解决途径,（,1,）没有特异蛋白带出现：,检查蛋白样品是否降解；,丽春红对膜染色，查看转印效果；,逐一验证所用抗体的有效性；,检查显色体系。,（,2,）非特异条带出现：,封闭不好,抗体浓度过大，适当减少抗体用量；,抗体特异性不好。,（,3,）整张膜背景深：,封闭不好,抗体浓度过大，适当减少抗体用量，,膜在实验过程中干过。,（,4,）条带弥散：,电泳分离效果不好，可能是胶凝得不充分；,电流不稳定也有可能导致条带不均匀。,（,5,）结果中无信号或显示信号弱：,检测样本不表达目的蛋白,检测样本低表达目的蛋白,转移不完全或过转移,抗体不能识别测试种属的相关蛋白,二抗与一抗不匹配,洗膜过度,.,22,4Western blot 常见问题分析可能遇到的问题及解决,1,其他现象,1,）,膜上多处出现黑点或黑斑原因：抗体与封闭试剂发生非特异性的结合。,2,）,蛋白分子量偏低或偏高原因：胶浓度不适合，高分子量要用低浓度胶；小分子蛋白要用