RNAi技术专题讲座PPT

,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,LOGO,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,RNAi技术,RNA的分类,Types,function,ribosomal RNA(rRNA),messenger RNA(mRNA),transfer RNA(tRNA),heterogeneous nuclear RNA,(hnRNA),small nuclear RNA(snRNA),small nucleolar RNA(snoRNA),small cytoplasmic RNA,ribozyme,microRNA(miRNA),small interfering RNA(siRNA),non-coding RNA(ncRNA),component of ribosome,template of protein synthesis,transfer amino acid,premature mRNA,participate the splicing and transfer of hnRNA,includes spliceosomal RNA,process and modify rRNA,recognize the protein sorting signal,catalytic RNA,usually endogenous,induce degradation of targeted mRNA,usually exogenous,induce degradation of targeted mRNA,all RNA other than mRNA,priorly functional RNA longer than 200nt,RNAi,技术,一、,RNAi,的发现,三、,RNAi,的作用机制,二、,RNAi,的,概念,四、,RNAi,的特点,五、,RNAi,的技术应用,六、,RNAi,的发展前景,RNAi,技术,AndrewFire,CraigMello,2006,年诺贝尔生理学奖,一、,RNAi,的发现,1998,年,Andrew Fire,和,Craig Mello,等人首次证实双链,RNA,分子可诱导同源目标,mRNA,降解，导致特定基因表达沉默，并将其命名为,RNA,干扰,2001,年,Tuschl,，,Phil Sharp,等人在,Nature,上首次证实哺乳动物细胞中存在,RNAi,机制,2002,年,Science,加州大学里弗塞德分校的,Shou-Wei Ding,等人首次证明动物细胞利用,RNA,沉默来抵御病毒侵染,2006,年,Eugene Koonin,等人又证明原核生物里存在类似于真核生物,RNA,干扰系统的,RNA,沉默机制,被,Science,杂志评为,2001,年的十大科学进展之一，并名列,2002,年十大科学进展之首。,RNAi,（,RNA interference,）,RNAi,（,RNAi interference,RNA,干扰,),是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。是一种转录后水平的基因沉默,(Post-transcriptional Gene Silencing,PTGS),。,二,、RNAi的概念,RNAi,现象的普遍性,RNAi,普遍存在于水稻、烟草、果蝇及人等几乎所有真核生物中；,RNAi,能高效的特异阻断基因的表达，在线虫和果蝇体内，,RNAi,能达到基因敲除的效果,直接向细胞导入长双链,RNA(dsRNA),，在细胞质核酸酶,Dicer,的作用下可将长双链,RNA,降解为,21-23bp,的小分子干扰,RNA,（,siRNAs,）,这些,siRNAs,结合其他元件形成,“,RNA,诱导沉默复合物,”,(RISCs),，并引导,RISCs,结合到与之互补的,mRNA,序列上，降解对应的,mRNA,导致对应蛋白质水平下降，最终导致目标基因表达沉默,(,见图，,线路,1,，蓝色,),非哺乳动物细胞RNAi技术路线,转录水平,转录后水平,RNAi,作用机制的两种水平,三、RNAi作用机制,哺乳动物细胞,RNAi,技术路线,直接制备,19-23bp,左右的,siRNAs,，将,siRNAs,转入哺乳动物细胞,(,线路,2,，红色,),或是将短发夹结构,RNA(,shRNAs,),的,DNA,表达载体转入细胞，表达产生,shRNA,，经过,Dicer,切割后得到,siRNA,(,线路,3,，黄色,),最后,siRNAs,和其他元件组合成为,RNA,诱导的沉默复合物,RISCs,，在,s,iRNA,指引下识别对应的,mRNA,序列并降解,mRNA,，从而使特定基因表达沉默,RNAi技术机制路线图,siRNA诱导的基因沉默,病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些,dsRNA,。,宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应，作用机制,其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（大约2123 bp），即,siRNA,。,siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成,RNA诱导的沉默复合物,（RNA-induced silencing complex，RISC)。,RISC,与外源性基因表达的,mRNA,的同源区进行特异性结合，,RISC,具有核酸酶的功能，在结合部位,切割,mRNA,，切割位点即是与,siRNA,中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂,mRNA,随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些,mRNA,的降解反应。,siRNA,不仅能引导,RISC,切割同源单链,mRNA,，而且可作为引物与靶,RNA,结合并在,RNA,聚合酶,(RNA-dependent RNA polymerase,，,RdRP,）作用下,合成更多新的,dsRNA,，新合成的,dsRNA,再由,Dicer,切割产生大量的次级,siRNA,，从而使,RNAi,的作用进一步放大，最终将靶,mRNA,完全降解。,Dicer(DCR,）,：是,RNAase,家族中的一员，主要切割,dsRNA,或者茎环结构的,RNA,前体成为小,RNAs,分子。对应地，我们将这种小,RNAs,分子命名为,siRNAs,和,miRNA,。,Dicer,有着较多的结构域，最先在果蝇中发现，并且在不同的生物体上表现出很高的保守性。,MicroRNA(miRNA,）,：是含有茎环结构的,miRNA,前体，经过,Dicer,加工之后的一类非编码的小,RNA,分子（,21-23,个核苷酸）。,MiRNA,，以及,miRISCs,（,RNA-,蛋白质复合物）在动物和植物中广泛表达。因之具有破坏目标特异性基因的转录产物或者诱导翻译抑制的功能，,miRNA,被认为在调控发育过程中有重要作用。,RNAi,具有的特征,RNAi,是转录后水平的基因沉默机制；,RNAi,具有很高的特异性，只降解与之序列相应的单个内源基因的,mRNA,；,RNAi,抑制基因表达具有很高的效率，表型可以达到缺失突变体表型的程度，而且相对很少量的,dsRNA,分子（数量远远少于内源,mRNA,的数量）就能完全抑制相应基因的表达，是以催化放大的方式进行的；,RNAi,抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限，在不同细胞间长距离传递和维持信号甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点；,dsRNA,不得短于,21,个碱基，并且长链,dsRNA,也在细胞内被,Dicer,酶切割为,21 bp,左右的,siRNA,，并由,siRNA,来介导,mRNA,切割。而且大于,30 bp,的,dsRNA,不能在哺乳动物中诱导特异的,RNA,干扰，而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡；,ATP,依赖性：在去除,ATP,的样品中,RNA,干扰现象降低或消失显示,RNA,干扰是一个,ATP,依赖的过程。可能是,Dicer,和,RISC,的酶切反应必须由,ATP,提供能量。,四、RNAi的特点,生物体内广泛存在的,RNAi,作用是什么？,在小分子,RNA,中发现了一类与调节基因表达密切相关的分子,micro RNA(miRNA),。这种内源性的小分子,RNA,针对,3,端非编码区，有着极高的,保守性,，并在组织中广泛表达，可在转录后以及翻译水平上调控基因表达。,病毒防御,RNA,沉默被认为是,低等生物,和,植物,抗病毒防御系统的一道防线,基因调控,五、,RNAi,技术应用,基因沉默工具,RNAi主要通过转录后水平阻断基因的表达，导致蛋白无法合成，出现“,基因沉默,”。比如，当关闭,非必须,或,致病,基因的功能。从理论上说，若能抑制致病基因的表达则很多疾病将被治愈,。,动物实验证明，可以通过RNAi的方法是胆固醇升高的基因“沉默”：病毒性疾病、眼疾、心血管代谢性疾病等方面的临床实验也正在进行；这一方法为病毒性肝炎，艾滋病，肿瘤等等人类顽疾的治疗指明道路,。,RNAi,文库,随着人类基因组计划的完成和蛋白质组研究的开展，我们的视野不再局限于单个的基因，整个研究领域都在期待呼唤更为强大的、全基因组高度的基因功能研究工具。,RNAi,文库,(RNAi library),是人工构建的能通过诱导沉 默众多不同基因表达的组合文库，可以用于建立功能缺陷,(loss of function),的生物或细胞库，进行表型的筛选。,临床疾病治疗,病毒性疾病的治疗,设计合成的,lenti,病毒载体引入,siRNA,，激发,RNAi,使其抑制了,HIV-1,的辅助受体,CCR5,进入人体外周淋巴细胞，而不影响另一种,HIV-1,主要的辅助受体,CCR4,，从而使以,lenti,病毒载体为媒介引导,siRNA,进入细胞内产生了免疫应答，由此治疗,HIV-1,和其他病毒感染性疾病的可行性大大增加,。,RNAi,还可应用于其它病毒感染如脊髓灰质炎病毒等,HIV-1 淋巴球出芽,遗传性疾病的治疗,美国西北大学的,Carthew R W,和日本基因研究所的,Ishizuka A,等人发现,RNAi,与脆性染色体综合征（与,FMR-1,基因,异常有关的导致智力低下的染色体病）之间的关系密切，揭示了与,RNAi,相关机制的缺陷可能导致人类疾病的病理机制。,遗传性疾病的,RNAi,治疗成为当今研究,RNAi,的又一大热点。,肿瘤病的治疗,RNAi,可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性，设计针对这一区段序列的,dsRNA,分子，只注射一种,dsRNA,即可以产生多个基因同时剔除的表现，也可以同时注射多种,dsRNA,而将多个序列不相关的基因同时剔除。,小鼠黑色素瘤细胞,在整形外科领域的应用前景,N-Ras,或,BRAF,的激活型突变是引发黑素瘤的主要病因，其中,66%,的病例为,BRAF,激酶作用域突变,，,而约,80%,的,BRAF,突变病例是因胸腺嘧啶突变为腺嘌呤造成第,599,位的缬氨酸突变为谷氨酸所致。,使用,RNAi,技术剔除黑素瘤细胞的,BRAF,表达，不仅抑制了肿瘤细胞生长，而且减弱了其侵袭能力，为黑素瘤基因治疗奠定了基础。,最近研究表明趋化因子受体,CXCR4,是乳腺癌转移的重要调节因素，其配体,CXCL12,可趋化肿瘤细胞并调节其增生和侵袭特性。使用,RNAi,干扰技术剔除,CXCR4,证实该分子为原位移植肿瘤生长和转移所必需。此外，剔除,BCRP,表达可以逆转其介导的肿瘤耐药。,在植物学中的应用,Napoli,等将,1,个查尔酮合成酶基因,(chs),置于,1,个强启动子后导人矮牵牛，试图加深花朵的紫颜色。结果部分花的颜色并非期待中的深紫色，而是形成了花斑状甚至白色，而且这种性状可以遗传。,由于导入的基因和其同源的内源基因