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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,幻灯片制作：WSY18,*,液相色谱柱的选择和方法开发,奥秘科技,/AUMI Technologies,（,US,）,液相色谱柱的选择和方法开发,内容概要,色谱基本概念回顾,色谱柱类型、选择和方法开发,内容概要色谱基本概念回顾,色谱基本概念回顾,色谱基本概念回顾,色谱（chromatography）,色谱原理,色谱分类：气相/液相和高效液相（HPLC）；反相/正相/离子交换/HILIC/混合固定相,色谱功能：分析（种类/定量），纯化,液相色谱仪器结构及功能：泵，脱气机，混合器，进样器（阀），色谱柱，柱温箱，检测器（流通池）,色谱（chromatography）色谱原理,分离度,Rs-Resolution,N Theoretical Plate Number,Selectivity,k Retention Factor,拖尾,分离度 Rs-Resolution,1.Separation of Compounds A and B,1.Separation of Compounds A an,灵敏度,：,Limit of Detection,：,Limit of Quantification,柱效,峰形（拖尾因子）,灵敏度：Limit of Detection,重现性,分离度（）,保留时间（，,）,选择性（,）,柱效（）,灵敏度,重现性分离度（）,色谱柱类型、选择和方法开发,色谱柱类型、选择和方法开发,色谱柱与色谱条件对色谱性能的影响,分离度,-,选择性,键合类型，基质表面特性；,流动相、温度,-,柱效,保留体积，粒径，柱长，基质表面特性；,流动相，温度，上样量，流速,峰对称性,基质表面特性，键合类型，,流动相，温度,保留体积,柱长，孔隙率，比表面积，基质表面特性，键合类型；,流动相，温度,灵敏度,粒径，基质表面特性，键合类型；,流动相，温度,稳定性和重现性,基质表面特性，键合类型；,流动相，温度,流动相,pH,，缓冲盐种类，溶剂；,色谱柱与色谱条件对色谱性能的影响分离度,影响色谱柱性能的主要因素,1,、,色谱柱的构型,色谱柱内径,色谱柱长度,2,、,固定相柱填料,粒径,比表面积,孔径,孔隙率,基质表面特性：,-,表面活性：硅胶纯度、硅羟基的酸性、均匀性和数量,-,耐碱性,键合类型,-,官能团、是否封尾,-,键合相的保留行为、耐酸性,影响色谱柱性能的主要因素,色谱柱的构型对色谱柱性能的影响,色谱柱的构型对色谱柱性能的影响,色谱柱的构型对色谱柱性能的影响：长度和直径,色谱柱尺寸 对色谱分离的影响：,短柱(15-100,mm)-,运行时间短,柱压低,长柱(150-250,mm)-,分辨率高,运行时间长,窄径柱(,2.1,mm),满足检测器和样品量限制,宽径柱(3-,7.8 mm,)-,载样量高，抗污染，寿命,制备柱,(,内径,10 mm),用于纯化制备,色谱柱的构型对色谱柱性能的影响：长度和直径色谱柱尺寸 对色谱,柱填料对色谱柱性能的影响,柱填料对色谱柱性能的影响,柱填料对,C18,色谱柱性能的影响：粒径,硅胶粒径和类型对柱效的影响,d,硅胶粒径和类型对压力的影响,柱填料对C18色谱柱性能的影响：粒径 硅胶粒径和类,柱填料对,C18,色谱柱性能的影响：粒径,II,目前市场主要可供选择的填料粒径,1.7,m,，,1.8,m,，,2.2,m,快速液相色谱柱：匹配快速色谱仪,2.7,m,多孔壳层：在常规液相色谱仪上实现快速分离,(Halo),3.0,m,，,3.5,m,普通快速分析,5.0,m,常规分析,颗粒越小，柱效越高,但是耐污染性能下降，柱压升高.,柱填料对C18色谱柱性能的影响：粒径II 目前市场,柱填料对,C18,色谱柱性能的影响：比表面积,每克填料的表面积，与粒度，孔径有关,比表面积大，保留增加，载样量增加，平衡时间增加,(,梯度洗脱尤为注意,),根据需要选择合适的比表面积,柱填料对C18色谱柱性能的影响：比表面积 每,柱填料对,C18,色谱柱性能的影响：孔径,I,多孔材料的,95%,以上表面在孔内部,样品分子直径小于平均孔径，才能进入微粒内部,孔径至少是样品流体学直径的,4,倍,300,孔径用于：超过,50,个氨基酸的肽或,25,个残基的低聚寡核苷酸,样品分子直径小于平均孔径，才能进入微粒内部,柱填料对C18色谱柱性能的影响：孔径I 多孔,柱填料对,C18,色谱柱性能的影响：孔径,II,由于小孔径填料比表面积大，小分子的保留值在小孔径填料通常更大,条件：,C8,色谱柱，,4.6150mm,，,3.5um,，,A,溶剂，,0.1%TFA,水溶液；,B,溶剂，,0.1%TFA,于,80%,乙腈,水中；,20min,梯度，,1030%B,；,60C,，,1.5ml/min,柱填料对C18色谱柱性能的影响：孔径II 由于小孔,柱填料对,C18,色谱柱性能的影响：硅胶纯度,I,2.3-,二羟基萘,2.7-,二羟基萘,TF=1.31,Brand W,AQ Column 5,m,4.6mm150mm,Brand Z,C18 Column 5,m,4.6mm150mm,Venusil MP C18 5,m,4.6mm150mm,Brand H,C18 Column 5,m,4.6mm150mm,Brand U,C18 Column 5,m,4.6mm150mm,！,TF=1.42,TF=1.39,TF=1.69,TF=,？,流动相：,甲醇：水,=65,：,35,流速：,1 mL/min,温度：,35,检测波长：,230 nm,进样量：,20 L,硅胶纯度金属含量,柱填料对C18色谱柱性能的影响：硅胶纯度I2.3-二羟基萘2,硅胶基质类型及发展史,Type A,：原料来源：水玻璃；高金属含量，高活性，极性化合物容易形成拖尾和死吸附,Type B,：原料来源：有机硅烷（四乙氧基硅烷）水解,/,烧结,/,酸洗,杂化及表面杂化,整体柱,壳层柱,硅胶基质类型及发展史Type A：原料来源：水玻璃；高金属含,柱填料对,C18,色谱柱性能的影响：硅胶纯度,II,硅胶纯度金属含量,d,柱填料对C18色谱柱性能的影响：硅胶纯度II 硅胶,固定相对色谱柱性能的影响：硅羟基的影响,残余硅羟基的影响,普通硅胶,当流动相的,pH,值大于,4.5-5.0,时，表面的硅羟基会带负电荷，碱性化合物拖尾。,解决方法,封尾,双层表面修饰,表面杂化,固定相对色谱柱性能的影响：硅羟基的影响残余硅羟基的影响,固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响,封尾,键合填料与小硅烷进行后续反应，如三甲基氯硅烷，反应掉部分残余硅羟基，以增加表面覆盖率,。,缺点：,不能完全反应（仍有,50%,的硅羟基未被反应）,在,pHC3C1,，长链之间差别不大,固定相对色谱柱性能的影响：基质表面特性+键合类型 反相键,反相键合相的保留行为,不同厂家色谱柱的,保留值，选择性与峰型,色谱柱：,4.6*150mm,，流动相：乙腈,0.05M,磷酸钾缓冲液，,pH3.2(65:35);,流速：,1ml/min,，,拖尾峰,T,0,（尿嘧啶）,P:,吡啶,L:,苯酚,N:,N,N-,二甲基苯胺,B:,4-,丁基苯甲酸,J:,甲苯,反相键合相的保留行为不同厂家色谱柱的拖尾峰T0（尿嘧啶）P:,固定相对色谱柱性能的影响：,基质表面特性,+,键合类型,键合相的稳定性,键合相的稳定性,低,pH,值，键合相流失,高,pH,值，硅胶溶解,影响色谱柱寿命，方法不重现,固定相对色谱柱性能的影响：基质表面特性+键合类型 键合,键合类型对键合相稳定性影响,低,pH,值，键合相流失,键合类型对键合相稳定性影响低pH值，键合相流失,键合类型对键合相稳定性影响（,II,）,空间位阻保护，延缓键合相流失,键合类型对键合相稳定性影响（II）空间位阻保护，延缓键合相流,固定相对色谱柱性能的影响：键合硅胶的稳定性,高,pH,值，硅胶基质溶解,pH9,时，色谱柱的稳定性,固定相对色谱柱性能的影响：键合硅胶的稳定性高pH值，硅胶基,固定相对色谱柱性能的影响：,键合硅胶的稳定性,碳杂化，延硅胶缓高,pH,值水解,杂化颗粒：,Waters,Xterra,表面碳杂化示意图,固定相对色谱柱性能的影响：键合硅胶的稳定性碳杂化，延硅胶缓,pH=12,条件下的稳定性,4 amines,ACN/1%Ammonia aqueous=25%:75%,40,o,C,4.6 x 150 mm,5um,1h,200 h,pH=12 条件下的稳定性4 amines,ACN/1%,总结：如何选择色谱柱和相应的色谱条件,了解目标化合物的性质：,结构（官能团）、,pKa,、分子量、浓度范围、溶解度、极性,了解色谱柱的性质,粒径，孔径，比表面积,保留强度和柱效；抗污染性,基质表面特性，键合类型,保留强度，选择性，柱效，对称性，灵敏度，稳定性和重现性,选择相应的色谱条件,总结：如何选择色谱柱和相应的色谱条件了解目标化合物的性质：结,色谱柱选择（）,替代：粒径，比表面，基质表面特性，键合类型相似,新方法开发：,粒径：,2um vs 3um vs 5um,（分析时间，灵敏度，仪器，价格，寿命）,内径柱长：内径,3mm vs 4.6 vs 7.8,（对分离影响不大，成本）；柱长与粒径相关,比表面：（低比表面耐污染，高比表面利于分离）,孔径：在满足比表面前提下大孔径较好,硅胶基质表面特性：）尽可能使用高纯硅胶；）尽可能使用低酸性硅胶；）当流动相,尽可能使用表面杂化；）使用多硅羟基残留，可加强对于极性化合物保留或削弱对于非极性化合物保留,键合类型：取决于选择性和流动相要求；具有一定极性的（）可以作为首选尝试；耐酸：选择；耐碱：,Durashell,封尾与不封尾：封尾削弱硅羟基影响；不封尾：提高硅羟基影响，增强极性物质保留，降低柱流失。,色谱柱选择（）替代：粒径，比表面，基质表面特性，键合类,乙腈水,乙腈水,乙腈水,KH2PO4 pH=4.2,乙腈水乙腈水乙腈水,
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