第六章细胞的冻复苏与运输课件

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第六章 细胞的冻存、复苏与运输,烤斡某雪葡掖侥朵葱闲粮丸尉遭氰搽尾爹胎椿湿梁网卓腮障凤循渠铣划碾第六章细胞的冻复苏与运输第六章细胞的冻复苏与运输,第六章,1,细胞冷冻、复苏的发展历史简介,1776年，Spallanzani最早发表了“冷”处理对“细胞”生命活动影响的报道。,到了1900年前后，科学家基本上肯定了生物成分(如精子)能够在零下温度贮存的事实。,1949年，Polge等人发现了,甘油,对低温下贮存细胞的保护作用。,Luyet(1951)与Lovelock(1953)等多位学者发现,电解质浓度增大,是造成冷冻贮存细胞损伤的主要原因。,1959年，Lovelock等人发现了一种新的化学保护剂，这就是现在人们熟知的,二甲基亚砜,(DMSO)。,当前低温液氮冻存贮存细胞已是细胞培养室常规性通用技术，贮存时间几乎是无限的。,璃廉沟哀肯芽型鳖贾齿炎萨尽句瑚紫擒堰灭磁振瘁孜极贮愉豺逐卵隙壹刑第六章细胞的冻复苏与运输第六章细胞的冻复苏与运输,2,一、培养物的冷冻保存与复苏原理,冷冻保存,(cryopreservation)：将体外培养物悬浮在加有,冷冻保护剂,的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度(一般是低于-70的超低温条件)，并在此温度下对其长期保存的过程。,复苏(thawing),：,是以一定的复温速率将冻存的培养物恢复到常温的过程。,无论是微生物、动物细胞、植物细胞还是体外培养的器官都可以进行冻存，并在适当条件下复苏。,镁筒赡轿骡厅瞒诊烁位被面漱符斌呸陛粪犀秘善孤洱吭躯刨乓赖瑶妮访霖第六章细胞的冻复苏与运输第六章细胞的冻复苏与运输,一、培养物的冷冻保存与复苏原理镁筒赡轿骡厅瞒诊烁位被面漱符斌,3,细胞冻存时，存在两种损伤：,冰晶损伤,溶质损伤,冰晶损伤：,由于温度下降，细胞内外的水分都会结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏并引起细胞死亡。这种,因细胞内、外结冰而致的细胞损伤被称为细胞的冰晶损伤。,冰晶损伤是由冷却速度过快造成，冷却速度越快，冰晶损伤越大。,鼎疹坦敝伟瘦爆轻绒卡进囱庚央蕊篮洲釜舱锌扎衙雨朵李币桌沟涨擎栏著第六章细胞的冻复苏与运输第六章细胞的冻复苏与运输,鼎疹坦敝伟瘦爆轻绒卡进囱庚央蕊篮洲釜舱锌扎衙雨朵李币桌沟涨擎,4,溶质损伤：,因保存溶液溶质浓度增高而致的细胞损伤被称为溶质损伤。,细胞悬浮在溶液中，随着温度的下降，细胞外部的水分会先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质的浓度升高。如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时间过长，细胞膜上脂质会受到损坏，细胞便发生渗漏。,溶质损伤是由冷却速度过慢，使细胞在高浓度的溶液中暴露的时间过长而造成，冷却速度越慢，此损伤越严重,埔跟傣器胳骸咕迸饰涩古周钳寐框珠翟斡苔棋继寞将车融淮棍喊谱均莱爬第六章细胞的冻复苏与运输第六章细胞的冻复苏与运输,溶质损伤：因保存溶液溶质浓度增高而致的细胞损伤被称为溶质,5,如果在溶液中加入冷冻保护剂时，则可保护细胞免受,溶质损伤,和,冰晶损伤,。,保护机理：,冷冻保护剂易同溶液中水分子结合，从而降低冰点，减少冰晶的形成；,通过降低未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质的损伤，细胞得以在超低温条件下保存。,闻伺酝丧薛杜寸墒鞋筷恤毁傈遁吱赃遵认酬轩伏锁否床委占也打敞佐箭崇第六章细胞的冻复苏与运输第六章细胞的冻复苏与运输,如果在溶液中加入冷冻保护剂时，则可保护细胞免受溶质损伤和冰晶,6,影响冷冻效果的因素有以下几点：,1.冷冻速率,不同的冷冻速度既然能使细胞内发生不同的生理变化，也可以对细胞产生不同的损伤。,当冷冻速度,过慢,时:细胞,脱水,严重，细胞体积严重收缩，超过一定程度时即失去活性。冷冻速度过慢，还会引起细胞外溶液部分结冰，从而使细胞外未结冰的溶液中溶质浓度增高，产生,溶质损伤,。,当冷冻速度,过快,时:细胞内水分来不及外渗，会形成较大冰晶,造成细胞膜及细胞器的破坏，产生细胞内,冰晶损伤,。,笛砍弹剑际秋仿涝引禹帝享湘竣像纱御相瞒壁婿秩羌舒适忱椿妊特榔卫固第六章细胞的冻复苏与运输第六章细胞的冻复苏与运输,影响冷冻效果的因素有以下几点：笛砍弹剑际秋仿涝引禹帝享湘竣像,7,2.冷冻保存温度：,液氮温度(-196)是目前最佳冷冻保存温度。,应用-70-80条件冷冻保存细胞，短期内对细胞活性无明显影响，但随着冻存时间延长，细胞存活率明显下降。,如-70冻存SNL细胞(一种小鼠成纤维细胞)，,一个月内复苏，细胞存活率在90%以上；,但一个月后，细胞存活率却降至50%左右；若时间再延长，细胞存活率更低甚至为零。,不同细胞的最适冷冻速率不同。,例如，小鼠骨髓干细胞、酵母、人红细胞的最适冷冻速率分别为1.6/min、7/min和200/min。,心展晴厨展胺拭赶厕韭辖迟焦烛能彝诵鹊角饿井狂幻衣绝姜罪搜涣跃系两第六章细胞的冻复苏与运输第六章细胞的冻复苏与运输,2.冷冻保存温度：不同细胞的最适冷冻速率不同。例如，,8,3.复温速率,复温速率是指在细胞复苏时温度升高的速度。,一般来说复温速度越快越好。常规的做法是:在37,水浴中，于12min内完成复温。,在冷冻复苏中遵循：慢冻速溶原则！,在复苏时，一般以很快的速度升温，12min内恢,复到常温，细胞内外不会重新形成较大的冰晶，也不会,暴露在高浓度溶质的溶液中过长时间，从而无冰晶损伤,和溶质损伤产生，冻存的细胞经复苏后仍保持其正常的,结构和功能。,坑飘牺掇檬败苑见抠米艰秒些政灭喘泰骆袖悄相扔应去丙圆恬败遍竭舶掇第六章细胞的冻复苏与运输第六章细胞的冻复苏与运输,3.复温速率坑飘牺掇檬败苑见抠米艰秒些政灭喘泰骆袖悄相扔应去,9,4.冷冻保护剂：,是指可以保护细胞免受冷冻损伤,的物质。,分为：渗透性：常用,甘油、,DMSO,非渗透性,甘油或二甲基亚砜这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。,盐意判寿增祥禹晃澈丸擎诺毁篆塑棘园捡鼓双锗焕迪荤惑爷玛瞳州励庞曰第六章细胞的冻复苏与运输第六章细胞的冻复苏与运输,4.冷冻保护剂：是指可以保护细胞免受冷冻损伤盐意判寿增祥禹晃,10,保护机制:,在细胞冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤；同时，细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩。,甘油和,DMSO,并不能防止细胞内结冰。在使用该类冷冻保护剂时，需要一定的时间进行,预冷,，让甘油或DMSO等充分渗到细胞内，在细胞内外达到平衡以起到充分的保护作用。目前，,DMSO,的应用比甘油更为广泛。,胁创亡舍裳题晚箱劫凤铜莉诡浓布漆摘象汗靳障培裕奢孩然账洁喂昨驹壤第六章细胞的冻复苏与运输第六章细胞的冻复苏与运输,保护机制:在细胞冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内,11,非渗透性冷冻保护剂不能渗透到细胞内，一般是些大分子物质。该类保护剂主要包括,聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白及羟乙基淀粉,等。其保护机制的假设很多，其中有一种可能是，聚乙烯吡咯烷酮等大分子物质可以优先同溶液中水分子相结合，降低溶液中自由水的含量，使冰点降低，减少冰晶的形成；同时，由于其分子量大，使溶液中电解质浓度降低，从而减轻溶质损伤。,证屋摈篓焊愿擎沾饿笑驶挝为逮簧桥拥腆骸攘旁班譬常缄退椭枢还峪型项第六章细胞的冻复苏与运输第六章细胞的冻复苏与运输,非渗透性冷冻保护剂不能渗透到细胞内，一般是些大分子物质。该类,12,注意：,由于许多冷冻保护剂(如DMSO)在低温条件下能保护细胞，但在常温下却对细胞有害，故在细胞复温融解后要及时洗除冷冻保护剂。,二、冷冻保存方法,按照冷冻保护液在冻结后是否形成冰晶来划分，冻存方法可分为,非玻璃化,和,玻璃化,冻存两种,简皂献多艾宪耳蚤敏忠狰礼稠摔盔稼您浮惦菏蟹坟材茅颜繁份膛娄望蝇花第六章细胞的冻复苏与运输第六章细胞的冻复苏与运输,注意：由于许多冷冻保护剂(如DMSO)在低温条件下能保护细,13,非玻璃化冻存,是利用各种温级的冰箱分阶段降温至-70-80，然后投入液氮进行保存；,该种方法冻结的细胞悬液或多或少都有冰晶的形成。,玻璃化冷冻,则是指利用多种高浓度的冷冻保护剂联合形成的玻璃化冷冻保护液保护悬浮细胞，直接投入液氮进行冻存的方法。以该中方法冻结的细胞悬液没有冰晶的形成。,比瞪凛跺做汾锐坟努怖醇题镁馒鉴健楞斡硕仅卖煎遇旬裴纹乔丸趟窄范力第六章细胞的冻复苏与运输第六章细胞的冻复苏与运输,非玻璃化冻存是利用各种温级的冰箱分阶段降温至-70,14,玻璃化冻存法对细胞活性的保存具有较好的效果，不需要复杂的仪器设备，具有液氮储存设备即可使用。,目前，该方法已在胚胎冷冻方面得到广泛应用，但,很少应用于一般细胞的冻存。,这可能与需要配制较复杂的冻存液以及冷冻前和复苏后较烦琐的操作有关。,缺铬齿越席曳坐献镁口耳窿症讯怀头路村眺掺咸壬畔五事沈杨脏痛乍朽百第六章细胞的冻复苏与运输第六章细胞的冻复苏与运输,玻璃化冻存法对细胞活性的保存具有较好的效果，不需,15,非玻璃化冻存冻存方法举例（肿瘤细胞）,1.主要材料,(1)仪器设备：普通冰箱、-30低温冰箱和-70-80超低温冰箱、液氮冻存罐、离心机等。,(2)冻存管：容量为1ml或1.5ml。,(3)冷冻保护液：一般是以含,20%小牛血清的细胞培养液与二甲基亚砜1份以9：1混合而成,。现配现用，或配制后放入普通冰箱冰盒内冷冻保存。使用前，于室温下水浴融解。,(4)待冻存细胞：各种肿瘤细胞,恃灸哀毡煌沫酣锗癌讼爽示皮洽脆脓统挨啼案抑陡惨莱酱藻辖翟姚旋脉槽第六章细胞的冻复苏与运输第六章细胞的冻复苏与运输,非玻璃化冻存冻存方法举例（肿瘤细胞）恃灸哀毡煌沫酣锗癌讼爽示,16,2.冻存过程,(1)待冻存细胞悬液的准备,按常规方法消化处于,对数生长期,的细胞培养物,制备成单细胞悬液,计算细胞总数。,将细胞悬液以8001000rmin离心5min，弃上清液。,向沉淀物中加入冷冻液。轻轻吹吸均匀，使细胞密度达,110,6,110,7,个,/ml。,按每管11.5ml的量，分装于冻存小管内。拧紧管盖。,在冻存小管上做标记，包括细胞代号及冻存日期。,丈咖蝉旨橙色制工绕索戊菏蔡掇寓嚣囊架盗瞪管赡剩铺嘘晶弓耶儿百探咖第六章细胞的冻复苏与运输第六章细胞的冻复苏与运输,2.冻存过程 丈咖蝉旨橙色制工绕索戊菏蔡掇寓嚣囊架盗瞪,17,(2)分级冷冻：,（有几种方法可以使用）,先将冻存小管放人普通冰箱冷藏层(4,8)，约40min。,接着置于普通冰箱冷冻层(-10-,20)，3060min。,再于-30放置30min左右（,可省略,）。,然后在-70-80下过夜。,最后将冻存小管投入液氮保存。,前卫邱钉崔了首灾饥瘤富瑟竭逗鬃戴广芒芭休什笨铲班审夸仲淳呸傍梭毕第六章细胞的冻复苏与运输第六章细胞的冻复苏与运输,(2)分级冷冻：前卫邱钉崔了首灾饥瘤富瑟竭逗鬃戴广芒芭休什笨,18,还有一种简单的方法，就是将冻存小管先悬挂在液氮罐口20 min，再直接投入液氮中保存。,第三种方法是，用4预冷的冷冻保护液悬浮细胞，分装冻存小管后，将冻存小管放在4下30min；然后置于壁厚1 cm以上的泡沫塑料小盒内封好，立刻将小盒放置在-70-80冰箱中24h以上至1周；再将冻存小管投入液氮中保存。,(3)记录：,做好冻存记录。记录内容包括冻存日期、细胞代号、冻存管数、冻存过程中降温的情况、冻存位置以及冻存经手人。,3.冻存结果,如此冻存的细胞，其存活率可达90%以上。,赦鞘驰雍汗尸鄂希鱼熏输棠拾鲁揭贴怪望镰境莹悬络止二挞鹿厉状嚣垛真第六章细胞的冻复苏与运输第六章细胞的冻复苏与运输,还有一种简单的方法，就是将冻存小管先悬挂在液氮罐口20 mi,19,注意事项：,在使用DMSO前，不需要对其进行高压灭菌，因其,本身就有灭菌作用。,在常温下，DMSO对人体有毒，故在配制冷冻保护,剂时最好带手套。,冻存管投入液氮时，动作要小心、轻巧，以避免,液氮从液氮罐内溅出。,应注意控