实验 血红蛋白及其衍生物的吸收光谱及

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验二 血红蛋白及其衍生物的吸收光谱测定,目的要求,掌握,722,型分光光度计的使用,了解血红蛋白及其衍生物的吸收光谱的测定,掌握血红蛋白标准曲线的绘制,实验原理,溶液中的物质在光的照射激发下，产生了对光吸收的效应，物质对光的吸收是具有选择性的，各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱，因此当某单色光通过溶液时，其能量就会被吸收而减弱，光能量减弱的程度和物质的浓度有一定的比例关系，也即符合于比色原理,-,朗伯,-,比耳定律,分光光度计的使用,朗伯比尔定律：,A=,lc,：摩尔吸光系数,c,：溶液的浓度,l,：液层的厚度,A,：物质的吸光度,比色皿的使用,手持毛玻璃面，不可触碰光滑面,使用前要再用少量（大约,1-2ml,）待测溶液润洗,1,次,使用时比色皿光滑面对准光路,使用后及时清洗（用海绵刷沾取肥皂液清洗比色皿，并用自来水冲洗干净，随后用蒸馏水润洗,1-2,次）,血红蛋白及其衍生物的吸收光谱测定,血红蛋白,(,Hb,),与,O,2,结合生成,氧合血红蛋白,(HbO,2,),，与,CO,结合生成,碳氧血红蛋白,(,HbCO,),。,因其血红蛋白分子结构不同，当光线分别透过各种,Hb,溶液时，所吸收的光波也各异，可显出特有的吸收光谱。这些吸收光谱可作为它们定性和定量分析的基础。,如,HbO,2,在可见光波长,400600nm,范围内有,3,个特征的吸收峰，其峰值分别在,415,、,541,和,576nm,处，当氧合血红蛋白转为碳氧血红蛋白（,HbCO,），此时光谱发生改变，在波长,419,、,540,和,569nm,处出现三个特征的吸收峰，其中在,500600nm,范围内,2,个特征的吸收峰如下图。,项目,吸收峰数,吸收光谱（,nm,）,HbO,2,2,541 577,HbCO,2,540 569,本实验先制备,Hb,及其衍生物，然后在不同波长下测其光吸收度，,以吸光度（,A,）,（又称光密度）为纵坐标，波长为横坐标绘制成吸收光谱曲线，由此可以确定它们最大的吸收波长,。,仪器和试剂,1,仪器：试管；吸量管；,量筒；,722,型分光光度计；,CO,发生器。,2,试剂：（,1,）浓,H,2,SO,4,；,（,2,）甲酸；,（,3,）蒸馏水；（,4,）血红蛋白溶液。,（,5,）,NaOH,；,实验操作,预热仪器,选定波长,调节,T=100,调节“,0”,点,测定,关机,分光光度计的使用,用草酸钾抗凝，取静脉血，边取边轻轻摇动，即制得全血。,（,1,）氧合血红蛋白（,HbO,2,）液：,加蒸馏水,20ml,，取全血,0.1ml,（,3,滴）盛于小烧杯中，混匀，此即,HbO,2,液，呈鲜红色。,（,2,）碳氧血红蛋白（,HbCO,),液：,取上述,HbO,2,液约,5ml,于试管中，通,CO,气体（浓硫酸与甲酸在,CO,发生器中反应发生）约,10,秒钟，,HbO,2,即变成樱桃红色的,HbCO,溶液。,1,样品的制备,：,2,吸光度测定：,（,1,）将如上制备的,2,种血红蛋白液分别盛于比色杯内，在,722,型分光光度计上以蒸馏水为空白调节吸光度零点和,100%,（,每一次读数均应用空白管调节零点和,100%,）。,（,2,）先从波长,500600nm,分别测定,HbO,2,，碳氧血红蛋白的吸光度（在相应峰值的,10nm,范围内每隔,2nm,记录一次吸光度读数，其余均每隔,10nm,记录一次吸光度读数）。,3.,吸收光谱曲线的绘制,以吸光度为纵坐标，波长为横坐标描点，并将各点连接成曲线，即为血红蛋白及其衍生物的吸收光谱，但由于使用仪器不同，绘制出的血红蛋白及其衍生物的吸收光谱必有一些差异，对,722,型分光光度计来说，峰值误差在,3nm5nm,波长内是允许的。,注意事项,分光光度计应放在干燥处，使用温度为,5,35,。远,离强电场、磁场,每次做完实验时，应立即洗净比色皿,为了防止光电管疲劳。不测定时必须将比色皿,暗箱盖打开，使光路切断，以延长光电管使用寿命,当仪器停止工作时，切断电源，电源开关同时,切断。并且用套子盖住仪器，做好使用登记,思考题,1,、什么叫吸收光谱？测定血红蛋白及其衍生物的吸收光谱有何意义？,2,、,Hb,属于哪类蛋白质，它的吸收光谱的特征反映它的什么结构成分？,