酶学分析技术PPT资料

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,11/7/2009,#,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,酶学分析(fnx)技术,第一页，共27页。,酶是生物体内活细胞合成的具有高效、特异(ty)催化作功能的蛋白质。,什么(shn me)是酶enzyme?,目前将生物催化剂分为(fn wi)两类:,蛋白质酶、核酶（脱氧核酶）,第二页，共27页。,底物(substrate,S)：被催化的物质。,产物(product,P)：反应生成的物质。,酶促反应：酶催化的反应。,酶活力：酶所具有(jyu)的催化能力。,几个有关(yugun)名词,丙氨酸,谷氨酸,第三页，共27页。,常见(chn jin)酶类,丙氨酸氨基转移酶ALT或GPT,乳酸(r sun)脱氢酶（LDH）,天冬氨酸氨基转移酶（AST或GOT）,肌酸激酶（CK）,5-核苷酸酶（5-NT),-羟丁酸脱氢酶（-HBD),第四页，共27页。,一、酶活性,定义：酶活性（enzyme activity）也称为酶活力(hul)，指酶促反应速率，即规定条件下在单位时间内产物的生成量或底物的减少量。,表示(biosh)方法：,或,式中v：反应速率，P：产物(chnw)浓度，t：时间，S：底物浓度。,注：在实际测定酶促反应速度时，以测定单位时间内产物的生成量为好。,第五页，共27页。,二、酶活性单位(dnwi),（一）酶活性单位(dnwi),定义：表示酶的相对含量，指在一定条件下，单位时间内,生成(shn chn)一定量的产物或消耗一定量的底物所催化的酶量。,表示方法：,惯用单位（一定的反应量,/,一定的反应时间）,国际单位,IU,（,mol/min,）,Katal,单位（,mol/s,）,第六页，共27页。,抗凝剂 某些酶可被抗凝剂抑制，如EDTA、草酸盐，可抑制需Ca2+的AMS和需Mg2+的CK、5NT、ALP等，酸酶活性测定都用血清。,20世纪60年代以前根据酶活性测定方法建立者的姓氏命名(mng mng)的单位,图5-1酶促反应进程曲线,底物转变为产物的酶量，为1U，1U=1mol/min。,优点(yudin)：多点测定结果，连接成线，很容易找到成直线的区段，因而可选择线性反应期来计算酶活性，不需终止反应，测定结果较准确。,第三节 影响(yngxing)酶活性测定的因素,NAD(P)或NAD(P)H偶联的脱氢酶及指示反应，NADH和NADPH在340nm有光吸收特性，可用紫外分光光度计直接测定，另外，NAD(P)H还有强烈荧光，其激发(jf)光波长为365nm，荧光波长为460nm，荧光法的灵敏度比分光光度法高。,t1 t2 时间(shjin)t,氨基移转酶的卡门氏单位(dnwi)（Karmen）,工具酶的质量要求 工具酶的用量一般较多，故要求工具酶来源广泛，价廉易得，纯度要求不太高，可降低制备成本，但对工具酶中的杂质也要有一定的限制(xinzh)，以保证工具酶有一定的比活性，减少或避免一些能干扰测定的副反应。,平衡法（end-paint amalyin）测定酶,该方法一般需要在反应进行到一定时间后用强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止反应。,第二十二页，共27页。,-羟丁酸脱氢酶（-HBD),（一）酶活性单位(dnwi),工具酶的质量要求 工具酶的用量一般较多，故要求工具酶来源广泛，价廉易得，纯度要求不太高，可降低制备成本，但对工具酶中的杂质也要有一定的限制(xinzh)，以保证工具酶有一定的比活性，减少或避免一些能干扰测定的副反应。,1惯用(gunyng)单位：,20世纪60年代以前根据酶活性测定方法建立者的姓氏命名(mng mng)的单位,ALP的金氏单位(dnwi)（King）,氨基移转酶的卡门氏单位(dnwi)（Karmen）,特点：各单位对温度、时间、物质量的定义不同，导致各测定值、参考范围相差很大，彼此间无法比较,现在临床应用较少。,卡门氏单位：血清在,25,，,340nm,，反应体积,3.0ml,光径时每分钟测定吸光度下降，即消耗,4.82,10,-4mol NADH,为一个卡门氏单位,举例：,金氏单位：,100ml,血清,ALP,在,37,与底物作用,15min,，产生,1mg,酚。,第七页，共27页。,2.国际(guj)单位IU（mol/min）,定义(dngy)：在规定条件下（25及其他最适条件），每min催化1mol,底物转变为产物的酶量，为1U，1U=1mol/min。,IFCC,2001,年,37,3Katal单位(dnwi),定义：,1Katal,是在规定条件下，每秒钟催化,1mol,底物转变为产物的,酶量。,1Katal,1mol/s,。,IU,与,Katal,单位的关系：,1katal=6010,6,U,，,1U=16.67nkatal,第八页，共27页。,三、酶促反应(fnyng)动力学,以产物生成量（或反应物减少量）为纵坐标、反应时间为横坐标作图所得到的一条曲线，称为(chn wi)反应进程曲线（或反应时间曲线、速率曲线、时间曲线）,t,1,t,2,时间,t,图,5-1,酶促反应进程曲线,吸光度,A,延滞期,线性期,非线性期,第九页，共27页。,（一）延滞(yn zh)期（lag phase、延迟期）,特点：为反应的初始(ch sh)阶段，反应速率一开始时较慢，通常为几秒到几分钟,t1 t2 时间(shjin)t,图5-1酶促反应进程曲线,吸光度,A,线性期,非线性期,R1,R2,延滞期,孵育期,延滞期,第十页，共27页。,（二）线性期,此阶段酶促反应速率基本保持恒定(hngdng)；,对底物而言，为反应速率与底物浓度S的零次方成正比的零级反应，即不受底物浓度的影响，而只与酶活性浓度成正比；,此时底物的消耗量小于5%，反应速率(sl)为反应初速率(sl)。,酶活性浓度越高，线性期就越短,线性度：判断线性期的一个指标，指吸光度（A）相对于时间（min）变化的可以接受(jishu)的程度。,线性度=前半段A/min后半段A/min/（前半段A/min后半段A/min）/2100,线性度值越小则线性越好。一般判断标准：不大于15，否则判为非线性,特点：可代表酶促反应速度,第十一页，共27页。,（三）非线性期（偏离(pinl)线性期、平坦期）,进入(jnr)非线性期的原因：,反应的不断进行，底物消耗越来越多，酶变性失活增加、可逆反应增强、产物抑制(yzh)增加等使得反应速率明显下降。,特点：,若为单底物的反应，则此时反应速率与单底物浓度,S,的一次方,成正比，为,一级反应,。,第十二页，共27页。,偶联：工具(gngj)酶与待测酶、工具(gngj)酶与工具(gngj)酶之间的联合。,工具酶：将作为试剂用于测定待测酶活性或底物(d w)浓度的酶。,工具(gngj)酶有氧化还原酶类、转移酶类和水解酶类,分类：,第二节 酶学分析的类型,第十三页，共27页。,表7-2 常用工具酶的名称及其缩写(suxi)符号,名 称 缩写(suxi)符号 名 称 缩写(suxi)符号,乳酸(r sun)脱氢酶 LDH,苹果酸脱氢酶 MDH,6-磷酸葡萄糖脱氢酶 G6PD,谷氨酸脱氢酶 GLDH,葡萄糖氧化酶 GOD,胆固醇氧化酶 COD,磷酸甘油氧化酶 GPO,过氧化物酶 POD,己糖激酶,HK,肌酸激酶,CK,丙酮酸激酶,PK,甘油激酶,GK,脂蛋白脂肪酶,LPL,胆固醇酯酶,CE,脲酶,肌酐酶,第十四页，共27页。,常用品工具酶主要是氧化还原酶类，部分转移酶类和水解酶类。,工具酶的质量要求 工具酶的用量一般较多，故要求工具酶来源广泛，价廉易得，纯度要求不太高，可降低制备成本，但对工具酶中的杂质也要有一定的限制(xinzh)，以保证工具酶有一定的比活性，减少或避免一些能干扰测定的副反应。,第十五页，共27页。,NAD(P)或NAD(P)H偶联的脱氢酶及指示反应，NADH和NADPH在340nm有光吸收特性，可用紫外分光光度计直接测定，另外，NAD(P)H还有强烈荧光，其激发(jf)光波长为365nm，荧光波长为460nm，荧光法的灵敏度比分光光度法高。,如 ALT测定 工具酶是LDH,第十六页，共27页。,二、酶活性的测定方法,测定方法分类(fn li)：,按照仪器检测(jin c)方法分类：分光光度法、浊度法、荧光法、,放射性核素法、电位滴定法、电极法、量气法。,按照(nzho)反应时间分类；分为定时法、连续监测法和平衡法。,按照检测对象分类,：分为直接法和间接法。,第十七页，共27页。,1、定时(dn sh)法,原理(yunl)：,定时法是固定时间法的简称，是指测定反应开始后一段时间（t1t2）产物的增加量或底物的减少量以测定酶活性的方法。该方法一般需要在反应进行到一定时间后用强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止反应。,特点：,优点：简单，因为最后测定时酶促反应已被终止，故比色时不需要(xyo)保温设备，显色剂的选择也可不考虑对酶活性的影响。,缺点：如果不做预试验则无法了解其酶促反应进程（t1-t2）是否为零级反应，故难以确保测定结果的准确性。,吸光度,A,t,1,t,2,时间,t,图,5-6,定时法的三种反应进程,2,3,1,定时法与两点法、终点法的区别,第十八页，共27页。,2.连续监测法（continuoue monitosing）,每隔一定时间(shjin)（1060s）连续测定酶反应,中产物或底物的变化,量称为连续监测法。,又称动力法或速率法，,终点法的测定两个时,间点，该法进行多点,连续测定。,第十九页，共27页。,优点(yudin)：多点测定结果，连接成线，很容易找到成直线的区段，因而可选择线性反应期来计算酶活性，不需终止反应，测定结果较准确。省时、省试剂。,缺点：分光光度计必须有保温装置，而且P或S应是可直接测定的化合物，如需加入其他试剂则必须考虑它们对待测酶活性是否有影响。,第二十页，共27页。,3.平衡法（end-paint amalyin）测定酶,反应开始后某一段时,间内(从t1t2)产物或,底物的总变化量称为(chn wi),终点法。而t1和t2是,反应历程中的两个点，,故又称两点法。,第二十一页，共27页。,优点：简便，测定产物时，酶反应被终止，显色剂的选择只考虑对酶活性的影响，分光光度计不需保温装置。,缺点：无法了解这段时间的反应是否都是零级反应，故难以保证(bozhng)结果的真实性。,第二十二页，共27页。,计算公式,:,产物的增加量 每单位规定的保温(bown)时间 1000（ml）,酶单位/升=,每单位规定的产物增加量 实际保温(bown)时间 实际标本用量（ml）,分光光度法测定(cdng)的公式：,（A测定(cdng)A对照）V总106 每单位规定的保温时间,酶单位/升=,LV标 实际保温时间,第二十三页，共27页。,第三节 影响(yngxing)酶活性测定的因素,一、标本,1.溶血 RBC中某些酶活性比血高，如LDH高150倍，AST高15倍，ALT高倍。,2.抗凝剂 某些酶可被抗凝剂抑制，如EDTA、草酸盐，可抑制需Ca2+的AMS和需Mg2+的CK、5NT、ALP等，酸酶活性测定都用血清。,3.样品存放时间，各种血清酶稳定性不同，如ACP、CK在室温下迅速失活，AMS、GGT则很稳定。,第二十四页，共27页。,二、测定条件的影响,1.温度 温度对酶活性的影响包括两个方面，一方面是温度升高，反应速度加快(ji kui)。另外一方面温度升高，会发生热变性，使酶活性降低。,第二十五页，共27页。,（1）温度的选择 37反应速度快，单位时间反应物质变化量大，测定灵敏度增加，保温时间短，25、30可使单位时间的散热