免疫共沉淀ImmunoprecipitationIP解析

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,免疫共沉淀,(COimmunoprecipitation),用抗体将相应特定分子沉淀的同时，与该,分子特异性结合的其他分子也会被带着一,起沉淀出来的技术。这种技术常用于验证,蛋白质之间相互特异性结合。,免疫共沉淀可分为细胞内过表达蛋白、细,胞内源性蛋白、组织内蛋白的免疫共沉淀。,基本原理,细胞裂解物中加入抗体，这样可与已知抗,原形成特异的免疫复合物，若存在与已知,抗原相互作用的蛋白质，则免疫复合物中,还应包含这种蛋白质；经过洗脱，收集免,疫复合物，然后分离该蛋白质，对该蛋白,质进行,N,端氨基酸序列分析，推断出相应的,核苷酸序列。将包含活性物质的组织或细,胞构建成,cDNA,文库，以上述核苷酸序列为,探针从,cDNA,文库中分离出,cDNA,克隆。,实验流程,（,1,）转染后,24-48 h,可收获细胞，加入适,量细胞裂解缓冲液（含蛋白 免疫共沉淀酶,抑制剂），冰上裂解,30min,细胞裂解液于,4,C,，最大转速离心,30 min,后取上清；,（,2,）取少量裂解液以备,Western blot,分析，,剩余裂解液加,1g,相应的抗体加入到细胞,裂解,液，,4,C,缓慢摇晃孵育过夜；,（,3,）取,10l protein A,琼脂糖珠，用适量,裂解缓冲液洗,3,次，每次,3,000 rpm,离心,3 min,；,（,4,）将预处理过的,10l protein A,琼脂糖,珠加入到和抗体孵育,过夜的细胞裂解液中,4,C,缓慢摇晃孵育,2-4h,，使抗体与,protein A,琼,脂糖珠偶连；,（,5,）免疫沉淀反应后，在,4,C,以,3,000,rpm,速度离心,3 min,，将琼脂糖珠离心至管底；,将,上清小心吸去，琼脂糖珠用,1ml,裂解缓冲液,洗,3,4,次；最后加入,15l,的,2,SDS,上样缓冲,液，沸水煮,5,分钟；,（,6,）,SDS-PAGE,Western blotting,或质谱,仪分析。,一、样品处理：,二、抗体,-agarose beads,孵育,三、抗体,-agarose beads,复合物洗涤：,四、鉴定,免疫共沉淀技术的应用,肿 瘤,酶与病毒,信号传导,寄生虫,免疫共沉淀技术的优点与局限性,优点,：,与蛋白质亲和层析一样，检测的产物 是蛋,白质的粗提物；,抗原与,相互作用的蛋白以细胞中相类似的,浓度存在，避免了过量表达所造成的人为效,应；,蛋白质以翻译后被修饰的天然状态存在；,复合物以天然状态存在，蛋白的相互作用,可以在天然状态下进行，可以避免人为影响，,可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复,合体,.,局限性,:,需要多克隆抗体或,mAb,，因而对大规模筛,选未知蛋白会遇到障碍。,免疫共沉淀同样不能保证沉淀的蛋白复合,物为直接相互作用的两种蛋白。,用于免疫共沉淀的抗体不总是与操作相合,适，与,Western blotting,或者,ELISA,相比容易出,现假阳性反应。,灵敏度不如亲和色谱高。,不适于检测构成巨大、不溶性的大分子结,构的蛋白质一蛋白质相互作用。,乙醇沉淀,dna,和异丙醇沉淀,dna,的区别,异丙醇和酒精都是有机溶剂，一般来讲，提取质粒的时候一开始都要用异丙醇沉淀，因为异丙醇沉淀的效果要好一些，但最后大多用酒精沉淀，因为酒精容易挥发，对下游的实验影响小。,异丙醇比较疏水，能很更好地沉淀核酸，用乙醇的目的是去盐，它比异丙醇更亲水，所以能去掉一些盐离子。有时还用,70%,的乙醇洗样品也是为了增加盐的溶解度。在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇，乙醇的极性要强于异丙醇，所以一般用,2,倍体积乙醇沉淀，但在多糖、蛋白含量高时，用异丙醇沉淀可部分克服这种污染，尤其用异丙醇在室温下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白污染更为有效。,异丙醇沉淀核酸时，高浓度盐存在将使大量多糖存在在溶液中，从而可达到去多糖的作用。但高浓度的盐存在会影响核酸的进一步操作，因此必须用乙醇多次洗涤脱盐。,异丙醇：优点：所需容积小且速度快，适用于浓度低，而体积大,DNA,样品的沉淀。,0.541.0,倍体积的异丙醇可选择性沉淀,DNA,和大分子,rRNA,和,mRNA,；但对,5sRNA,、,tRNA,和多糖产物不产生沉淀，一般不需要在低温条件下长时间放置。,缺点：易使盐类（如,NaCl,、蔗糖）与,DNA,共沉淀；在,DNA,沉淀中异丙醇难以挥发除去，所以常规需要用,70,的乙醇漂洗,DNA,沉淀数次。,乙醇：沉淀,DNA,乙醇是首选的有机溶剂，对盐类沉淀少，,DNA,沉淀中所含的衡量乙醇易蒸发去处，不影响以后的实验。在适当的盐浓度下，,2,倍样品容积的,95,乙醇可有效沉淀,DNA,，对于,RNA,则需要将乙醇量增加至,2.5,倍,.,