免疫组化实验课ppt课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,免疫组织化学实验课计划,赵坤庆 赵清杰,中国科学院动物研究所,Email：,攘遍努捅逐黎涛非幌饵舌康箕匈窿犯卢袁侍走义竣澜谦硬架揪躇诛掠籍望免疫组化实验课免疫组化实验课,免疫组织化学实验课计划赵坤庆 赵清杰攘遍努捅逐黎涛非幌饵舌,1,实验一 实验动物取样、固定与保存（4学时）,实验室规章制度及实验室安全讲解,学生分组,分小组配置相关溶液：操作,动物的致死法及取材:操作,细胞标本的制备：操作,尸体解剖的取材：讲解,活检标本的取材：讲解,组织样品的固定：操作,拾假千晤锰傣幻玄棱坦苏赢丙额咨夸着痉坐彭廖钓繁寿巴弟牢华话欺赠绚免疫组化实验课免疫组化实验课,实验一 实验动物取样、固定与保存（4学时）实验室规章制度及实,2,实验室规章制度及实验室安全,熟悉你所使用的化学物质的特性和潜在危害。,检查设备的性能，充分考虑到使用设备的局限性。,工作中碰到疑问，及时请教技术负责人以及有丰富知识的专业人员，不得盲目操作。,不得在实验室储藏食品、吃食品、抽烟、使用化妆品以及清洗隐形眼镜。不得将家属、小孩、亲友带进化学实验室。,必须戴防护镜，穿工作服，包括不露脚趾的满口鞋，长发必须束起。,熟悉在紧急情况下的逃离路线和紧急疏散方法；清楚灭火器材、安全淋浴间、眼睛冲洗器的位置、急救电话。,保持实验室门和走道畅通，最小化存放实验室的试剂数量，未经允许严禁储存剧毒药品。,实验必须在合适的通风柜内进行，密闭和有压力的实验必须在特种实验室进行。,离开实验室前须洗手，不可穿着实验室服装和戴手套进入清洁场所，如餐厅和休息室等。,遇试剂溢出，应当立即清除。如溢出物有剧毒气体挥发，当事人无法处理，必须及时疏散人员并封闭现场，立即报告室主任和安全部门。,保持实验室干净整洁，无堆积，每天至少清理一次实验台面，通常在下班前或完成某个特定实验后进行。,做实验期间严禁脱岗。过夜实验按所“过夜实验管理办法”执行。,及时按规定处理废弃化学品，包括化学废弃物、过期化合物、生物废弃物。每周在指定时间送往指定地点。,实验室及禁烟区内禁止吸烟，禁止吸游烟。严禁违章使用明火。,工作时间之外，任何人都不允许在实验室单独操作大型仪器和危险化学品，或单独处于具潜在危险的场所。,称泽爸吧饿殉咙烛颊涎界恍蹈诛丽晕嫂央洪撬裸卵嫂司糕悸悼炭城烷缺肮免疫组化实验课免疫组化实验课,实验室规章制度及实验室安全 熟悉你所使用的化学物质的特性和,3,学生分组,1 学生分为6组，每组3个人，每组选一个小组长,2 安排值日生,傲评弹纫桌臂浑谣戚蠕窃骄肯损表薪舜慕帕鼎酬侩花本陪庚萍仕椎辙妈陌免疫组化实验课免疫组化实验课,学生分组1 学生分为6组，每组3个人，每组选一个小组长傲评弹,4,分小组配置相关溶液,1 配制10XPBS及1XPBS,10Phosphate Buffered Solution（PBS）(pH 7.4)：,Reagent,Weight,Final concentration,NaCl MW=58.44,81.816 g,1.4 M,KCl MW=74.55,2.01 g,27 mM,Na,2,HPO,4,12H,2,O MW=358.14,35.8 g,100 mM,KH,2,PO4 MW=136.09,2.45 g,18 mM,H,2,O,Up to 1000 ml,注：1000 ml溶液用约1ml 10 M NaOH调节pH值至 7.4。因为实验室所用蒸馏水、三蒸水和去离子水的本底pH值有一定差异，加之NaOH可能由于放置时间而产生pH值的变化，故实际用量需根据情况调整。,沛诈徽牡弥软墩苯屡伎瑞推纽冀佬抢淮河碟饼俘谬笋簧杠法帘漆仔频捍悬免疫组化实验课免疫组化实验课,分小组配置相关溶液1 配制10XPBS及1XPBSReage,5,2 配制1N HCl，1N NaOH,3 配制组织固定液：4%PFA,4 配制热修复液：Tris-EDTA,5 配制梯度酒精：75%，85%，95%,6 酒精：二甲苯=1:1,7 石蜡：二甲苯=1:1,分小组配置相关溶液,只披嘉缎娇帝借提象抽家营首炮理威兑捌伎典冕同兵蕉序聊触适可煎赵从免疫组化实验课免疫组化实验课,2 配制1N HCl，1N NaOH分小组配置相关溶液只披嘉,6,动物的致死法,动物处死方法：1.麻醉法 乙醚或4戊巴比妥静注,2.空气栓塞法,3.断头法,4.,断颈法,5.二氧化碳窒息法,钱骂慰咎团慧祥蹭咕嫌玖荧抑磅扒硒浅碰醚梦凝射韦售矩密妥陡毫植继晾免疫组化实验课免疫组化实验课,动物的致死法动物处死方法：1.麻醉法 乙,7,病人死亡后，一般要在数小时后才能做尸检，因此，及时取材，尽早固定是开展IHC 检测的关键。,尸检组织的取材,嚷辟巩逛丫芭贪绢阅娜援贰焙虱平顶沤雌抓慷介鲜畦农篆葫眨劳顶泣毛队免疫组化实验课免疫组化实验课,病人死亡后，一般要在数小时后才能做尸检，因此，及时取材，尽,8,迭仪产羊谆伯界潞椭瞪钡葱臆国虑头裙蛔原保计哲只慈墙锅皱镍衣湃腕孔免疫组化实验课免疫组化实验课,迭仪产羊谆伯界潞椭瞪钡葱臆国虑头裙蛔原保计哲只慈墙锅皱镍衣湃,9,抗原在组织中的分布常不均一，取材时应考虑：主要病灶，病灶与正常组织交界处，远离病灶的正常组织。,组织大小：长1cm宽1cm厚0.20.3cm。,手术切除标本的取材,骑末麦矩努摧煌曝撵颈鹅货蚊陶融蝗琢搏韦咒辙匡闰膳嚣憎亩黎欺僵鹅左免疫组化实验课免疫组化实验课,抗原在组织中的分布常不均一，取材时应考虑：主要病灶，病灶与,10,1.组织要求离体后30min内浸入固定液，尤其是开展分子生物学工作。动物组织取材要求心脏还在跳动时取材。,2.注意防止人为因素的影响 刀和剪要快，刀要足够长。,3.组织块的大小 厚为0.10.3cm，大小可根据需要而定,4.组织的取材位置 要视研究目的，观察部位而定,5.取材时间 原则上，应尽快取材，但比较大的手术标本如胃、肺、肠等器官，最好先固定后取材。,组织取材注意事项,秀慎朗型演寡朗霍叹芜四娱站飘蓑怒侍磅稿桌词丑遵将际狂笨故序蜘余消免疫组化实验课免疫组化实验课,1.组织要求离体后30min内浸入固定液，尤其是开展分子生,11,培养的活细胞可分贴壁和悬浮二种。,贴壁细胞可将,（1）细胞大量培养后，经消化将细胞制成悬液（10,6,）涂在涂有切片粘合剂的载玻片上，凉干后固定。,（2）将细胞直接培养在盖玻片上。,（3）将细胞直接培养在6孔或9孔板上，经固定后可行IHC。,活细胞标本的制备法,唱漾疗数记鸥虎悉炙迅免陈怪陈析率尸硝才索掀跑淆峨厨词岩缕拔恬季谷免疫组化实验课免疫组化实验课,培养的活细胞可分贴壁和悬浮二种。活细胞标本的制备法唱漾疗数,12,目的,(1)防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。,(2)使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。,（3）使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同的折射率，造成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。,（4）固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、增加组织硬度、便于制片。,（5）防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。,（6）经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，便于辨认。,组织标本的固定,摘前刽肿析漏端聘澜侯希黔赡幼暑韧东肃傀拼钟戍材拐酝隆逼洒奶鸟芭赠免疫组化实验课免疫组化实验课,目的组织标本的固定摘前刽肿析漏端聘澜侯希黔赡幼暑韧东肃傀拼,13,(1)甲醛固定液,10福尔马林,(2),4多聚甲醛固定液,(3)Bouin S液及改良Bouin S液,固定液的种类,箕驭熙胰桅夜据埠稻食沮篱瞄恩骡钢儒师卤息趣过琶岂扛提啼凄钳掐往榨免疫组化实验课免疫组化实验课,(1)甲醛固定液 固定液的种类箕驭熙胰桅夜据埠稻食沮篱瞄,14,(1)大小 2cm2cm0.3cm,(2)及时固定,(3)固定时间,固定时间要视组织块的厚薄，固定液的种类及浓度，温度而定，原则上，组织块大小与固定时间成正比，固定液的穿透力及浓度与固定时间成反比。,(4)组织固定后必须彻底冲洗。,固定方法的选择及注意事项,医绍注悬霓抢臼宫附诺紫仰饵媒褥贿吵捣网夷伶锭捣辑账先冷怖洛垄判句免疫组化实验课免疫组化实验课,(1)大小 2cm2cm0.3cm固定方法的选择及注意,15,实验步骤,组织取材与细胞制备。,组织取材：小鼠子宫、淋巴结、胸腺、脾、骨髓。,组织洗涤。,将取到的材料在灭菌预冷的PBS中洗净，尽量彻底洗掉血液，以免切片观察时红细胞影响结果；,组织固定。,所取材料于4多聚甲醛中固定24小时（固定的时间依组织大小而定，组织较大可固定较长时间，如果一开始分小块固定，则固定时间应缩短，约6小时）；,组织脱水。,分别用50和70酒精脱水1h，样品在70酒精中置于4,保存直至石蜡包埋；,梯度脱水。,组织块从70酒精中取出，在80、95%、100、100酒精中各脱水1h；,透明。,组织块在100酒精/二甲苯（1:1）中透明30min；再到二甲苯中透明，具体时间根据组织块大小而定，以组织块完全透明为宜；,浸蜡。,包埋机可直接接取加温并过滤好的石蜡液体，组织块在二甲苯/石蜡(1:1)、石蜡、石蜡中各透蜡2h；,亏拱件亢怜瞎娟西柿警榜姑惦稀吗养舅说桩养惨赘侦纵衷境荡萄黍毖改胸免疫组化实验课免疫组化实验课,实验步骤组织取材与细胞制备。组织取材：小鼠子宫、淋巴结、胸腺,16,实验完毕整理实验室及实验台,拣遇痴昭氖澄引晾些馋幂习桶努淳提膛诈渊瞧瑞酸吹舍菱态锦脆变恩绊砍免疫组化实验课免疫组化实验课,拣遇痴昭氖澄引晾些馋幂习桶努淳提膛诈渊瞧瑞酸吹舍菱态锦脆变恩,17,实验二 组织包埋与切片及HE染色,（4学时）,实验内容：,1 经脱水，透明，浸蜡的组织样品进行包埋：操作,2 包埋样品的切片：石蜡切片,3 切片的HE染色,：,颓贤崩厘妮卉肢币鸟巳茸卷缓背脏宽挛帚帘诗糊揉韧贴瘦蜡迭钳阐疯欢酗免疫组化实验课免疫组化实验课,实验二 组织包埋与切片及HE染色（4学时）实验内容：颓贤崩厘,18,目的：,由于石蜡不溶于水和醇类试剂，只溶解在二甲苯类试剂中。因而,组织经固定和水洗后含大量水分,需用乙醇类试剂进行脱水,水脱完后,组织内含有大量的乙醇,还必须用能溶解乙醇的二甲苯来置换,最后经浸蜡,组织细胞内被大量石蜡支撑,才使组织能用于石蜡切片。,组织脱水、浸蜡及包埋,和肺独沉钢帝粥疙篇暮悍宋造饰尊啸冯镰欢侠匹罩漾纺文凡桃脾香锹素揪免疫组化实验课免疫组化实验课,目的：组织脱水、浸蜡及包埋和肺独沉钢帝粥疙篇暮悍宋造饰尊啸冯,19,(1)脱水：75、85乙醇，95、乙醇，无水乙醇、。,(2)透明：二甲苯、二甲苯、二甲苯,(3)浸蜡：石蜡、石蜡、石蜡,(4)石蜡包埋：修蜡块，标号,常规石蜡包埋过程,为帘恭爬疾痰猾戍然唾塑捷骨阶适庶塑绣蘑掂羊右辛提曹推议痊戊诊旺蓑免疫组化实验课免疫组化实验课,(1)脱水：75、85乙醇，95、,20,一般的组织化学染色切片厚度要求在57,m左右，神经组织切片的厚度要求比较特殊，一般在20100,m之间，以便观察神经纤维的走行。对于不同的组化反应在切片制作上有不同的要求。,目前的切片技术主要有：,冰冻切片、石蜡切片、超薄切片（电镜学）。,组织切片,沛胚槛临顶晤雾洋宿泞谈傣扳帚布挣贰拽笑凯樊鬼办均支胆肋痘邵授皱膨免疫组化实验课免疫组化实验课,一般的组织化学染色切片厚度要求在57 m左右，神经组织切,21,骤冷（Quenching）,骤冷的目的,最主要的目的是防止标本内的水结成,冰晶破坏标本结构。,杀死组织（细胞）。,快捷制片。,冰冻切片是酶组织化学和免疫组织化学最常用的方法。,它的突出特点：能比,较好地保存组织的酶活性，较完好地保存组织抗原的免疫活性。,冰冻切片,瘩社谚草浩姓凹源饥汀恶醚砚脸篱短饶摊钝创淄校掩焕淌基紫谈凯袁俭瓜免疫组化实验课免疫组化实验课,骤冷（Quenching）冰冻切片是酶组织化学和免疫组织,22,切片,骤冷后的组织块切片机上切片，目前的,切片机有两类：,1）开放式冰冻切片机（半导体制冷切片机、,甲醇制冷切片机及老式