资源描述
单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,精选可编辑ppt,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,精选可编辑ppt,*,1,精选可编辑ppt,蛋白质分离的原理：,根据蛋白质各种特性的差异，如分子的,形状,和,大小,、所带,电荷的性质和多少,、,溶解度,、,吸附性质,和对其他分子的,亲和力,等等，可以用来分离,不同种类,的蛋白质。,一、基础知识,2,精选可编辑ppt,凝胶色谱法,（分配色谱法）,1,、概念：根据被分离物质（如蛋白质）,相对分子质量的大小,，利用具有,多孔网状结构,的凝胶的分子筛作用，来进行分离。,性质：微小的多孔球体,本质：多糖类化合物,实例：葡聚糖、琼脂糖,3,精选可编辑ppt,提取分离方法,凝胶色谱法,凝胶电泳法,4,精选可编辑ppt,凝胶色谱法分离蛋白质,5,精选可编辑ppt,6,精选可编辑ppt,相对,分子质量,大,小,直径大小,大于凝胶颗粒孔道直径,小于凝胶颗粒孔道直径,运动路径,被阻挡在凝胶颗粒,外面,而,迅速,通过,因扩散进入凝胶,颗粒内,部而被滞留,运动速度,较快,较慢,运动路程,较短,较长,洗脱次序,先,后,2、,凝胶色谱法的原理,7,精选可编辑ppt,（二）缓冲溶液,能够抵制,外界的酸和碱,对溶液,PH,值,的影响，维持,PH,基本,不变。,1,、作用,:,2,、缓冲溶液的配制,:,通常由,1,2,种缓冲剂,溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的,使用比例,就可以制得在,不同,PH,范围内,使用的缓冲液。,8,精选可编辑ppt,（二）缓冲溶液,3,、,在本课题中使用的缓冲液是：,磷酸缓冲液,成分：,NaH,2,PO,4,/Na,2,HPO,4,9,精选可编辑ppt,（三）电泳：,1,、概念：,带电粒子在,电场,作用下发生迁移的过程。,10,精选可编辑ppt,2,、原理：,许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有,可解离的基团,，在一定的,PH,下，这些基团会,带,上正,电,或,负,电。,在,电场,的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷,相反,的电极移动。,电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的,大小，形状的不同,，使带电分子产生,不同的迁移速度,，从而实现样品中各种分子的分离,。,11,精选可编辑ppt,3,、类型,:,琼脂糖,凝胶电泳、,聚丙烯酰胺,凝胶电泳,。,12,精选可编辑ppt,聚丙烯酰胺凝胶电泳,在测定蛋白质分子量时常用,十二烷基硫酸钠（,SDS,）,聚丙烯酰胺凝胶电泳,。,聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂,N,N,-,亚甲基双丙烯酰胺在,引发剂,和,催化剂,的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。,N,N-,亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）,丙烯酰胺和交联剂,N,N-,亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应,13,精选可编辑ppt,蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的,迁移率,取决于它所带,净电荷的多少以及分子,的大小等因素。,14,精选可编辑ppt,SDS,能使蛋白质发生完全,变性,。由几条肽链组成的蛋白质复合体在,SDS,的作用下会,解聚成单条肽链,，因此测定的结果只是,单条肽链的分子量,。,SDS,能与各种蛋白质形成,蛋白质,SDS,复合物,，,SDS,所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子,原有的电荷量,。因而掩盖了,不同种蛋白质间的电荷差别,，,使电泳迁移率完全取决于分子的大小,。,SDS,作用机理,:,15,精选可编辑ppt,实验操作步骤,1,、,样品处理,2,、粗分离,3,、纯化,4,、纯度鉴定,16,精选可编辑ppt,水分,血浆,固体物质,血液,白细胞,血细胞,血小板,红细胞,血红蛋白（,90,）,血液有哪些成分？,17,精选可编辑ppt,血红蛋白,两个,肽链,两个,一肽链,四个亚铁,血,红素基团,每个肽链环绕一个,亚铁血红素基团，,此基团可携带,一分子氧或一分子二氧化碳，,血红蛋白因含有,血红素,而呈,红色。,血红蛋白的特点：,18,精选可编辑ppt,1,、红细胞的洗涤,2,、血红蛋白的释放,3,、分离血红蛋白溶液,4,、透析,（一）样品处理,19,精选可编辑ppt,问题：,1,、刚采集的血样要做,怎样的处理？为什么？,加入抗凝血剂，,防止血液凝固。,2,、怎样洗涤？,采样分离吸浆倒红加液搅拌重洗三次,低速短时间离心 生理盐水,1,、红细胞的洗涤,20,精选可编辑ppt,3,、洗涤的目的是什么？,去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化。,4,、洗涤干净的标志是什么？,直至上清液,不再呈现黄色,，表明红细胞已洗涤干净。,1,、红细胞的洗涤,21,精选可编辑ppt,2,、血红蛋白的释放,问题：,加蒸馏水和甲苯的作用是什么？,使红细胞破裂，释放出血红蛋白。,22,精选可编辑ppt,有机溶剂,（无色透明的甲苯层）,脂类物质,（白色脂溶性物质沉淀层）,血红蛋白溶液,（红色透明液体）,红细胞破碎物沉淀（暗红色沉淀物）,3,、分离血红蛋白溶液,高速离心滤纸过滤漏斗分液,23,精选可编辑ppt,血红蛋白,24,精选可编辑ppt,(4),透 析：,过程：,取,1ml,的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有,300ml,的物质的量浓度为,20mmol/l,的,磷酸缓冲液,中（,pH,为,7.0,），透析,12,小时。,透析目的：,除去样品中分子量较小的杂质。,25,精选可编辑ppt,26,精选可编辑ppt,2.,凝胶色谱操作,:,（,1,）凝胶色谱柱的制作：,27,精选可编辑ppt,（,2,）凝胶色谱柱的装填,凝胶的选择,：,A,、材料：交联葡聚糖凝胶（,G-75,）。,B,、代表意义：,“,G,”,表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围,。,75,表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水,7.5,克。,凝胶的前处理,：,计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。,28,精选可编辑ppt,凝胶色谱柱的装填方法,：,A,、固定：将色谱柱装置固定在支架上。,B,、装填：将凝胶悬浮液,一次性,缓慢倒入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。,注意：,1,、凝胶装填时,尽量紧密,，以降低凝胶颗粒之间的空隙。,2,、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。,（,2,）凝胶色谱柱的装填,29,精选可编辑ppt,洗涤平衡,：,注意：,1,、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。,2,、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象,。,50cm,高,（,2,）凝胶色谱柱的装填,30,精选可编辑ppt,（,3,）样品加入与洗脱,调节缓冲液面：,打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。,滴加透析样品：,吸管吸,1ml,样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。,31,精选可编辑ppt,注意：,正确的加样操作是：,1,、不要触及并破坏凝胶面。,2,、贴壁加样。,3,、使吸管管口沿管壁环绕移动。,32,精选可编辑ppt,样品渗入凝胶床：,加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口,洗脱：,小心加入,pH=7.0,的,20mmol/l,的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。,收集：,待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每,5ml,收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）,33,精选可编辑ppt,34,精选可编辑ppt,（三）,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做）,鉴定血红蛋白纯度。,1.,目的：,35,精选可编辑ppt,1.,样品的处理,通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液,2.,样品的粗分离,经过透析去除分子量较小的杂质,3.,样品的纯化,通过凝胶色谱法,将相对分子质量较大的杂质蛋白除去,4.,经,聚丙烯酰胺凝胶电泳,进行,纯度鉴定,。,小结：,你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？,36,精选可编辑ppt,观察你处理的血液样品离心后,是否分层,（见教科书图,5-18,），,如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。,此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。,三、结果分析与评价,1,、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？,37,精选可编辑ppt,2,、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？,由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得,均匀,。此外，还可以加入大分子的有色物质，,例如蓝色葡聚糖,2000,或红色葡聚糖，,观察色带移动的情况。如果,色带均匀、狭窄、平整,，说明凝胶色谱柱的性能良好。,如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。,38,精选可编辑ppt,如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；,如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。,3,、你能观察到蛋白质的分离过程中红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？,39,精选可编辑ppt,
展开阅读全文