第十章-转基因植物的检测与鉴定课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第九章 转基因植物的检查与鉴定,第九章 转基因植物的检查与鉴定,第九章 转基因植物的检查与鉴定,第一节 报告基因的表达检测,第二节 外源基因整合的,Southern,杂交鉴定,第三节 外源基因转录的,Northern,杂交检测,第四节 外源基因表达蛋白的检,测,第九章 转基因植物的检查与鉴定第一节 报告基因的表达检测,报告基因的两大特点：,表达产物及产物的类似功能在未转化的植物细胞内并不存在；,便于检查,目前常使用的报告基因,GFP,，,GUS,，,BAR,，,NPTII,等,第一节 报告基因的表达检测,报告基因的两大特点：第一节 报告基因的表达检测,1,、,gfp,（绿色荧光蛋白）基因,简介：,绿色荧光蛋白是一些腔肠动物所特有的生物荧光素蛋白。生物荧光素蛋白是指存在于生物体的、能在激发光作用下发射出荧光的蛋白质。它是一种能接受荧光辐射能并最终发射荧光的物质。,从水母中分离纯化的,Gfp,是由,238,个氨基酸残基组成的单体蛋白，分子量,26888Da,，它在蓝光激发下能发出绿光。,1、gfp（绿色荧光蛋白）基因简介：绿色荧光蛋白是一些腔肠动,Gfp,作报告基因的优点：,适用于各种生物的基因转化；,检查方法简便，无需底物、梅、辅因子等物质；,便于活体检测；,检测是可获得直观信息。,Gfp作报告基因的优点：,2,、,gus,（,-,葡萄糖苷酸酶）基因,Gus,基因存在于某些细菌体内，是一种水解酶，能催化许多,-,葡萄糖苷酯类物质的水解。,检测方法：,组织化学染色定位法,以,X-Gluc,为底物，通过显色反应可直接观察到组织器官中,gus,基因的活性。在适宜的条件下，该酶可将,X-Gluc,水解成蓝色物质，此靛蓝染料使具有,Gus,活性的部位或位点呈现蓝色，用肉眼或显微镜即可观察。,2、gus（-葡萄糖苷酸酶）基因Gus基因存在于某些细菌体,第二节 外源基因整合的,Southern,杂交鉴定,Southern,杂交,是以,DNA,或,RNA,为探针，检查,DNA,链，用于外源基因,整合,的鉴定及分析。,具有灵敏度高（可检出,1pgDNA,样品）；特异性强（可鉴别出,20,个碱基对左右的同源序列）的特点,根据杂交时所用的具体方法分为：,印迹杂交,、,斑点或狭缝杂交,和,细胞原位杂交,等。,分子杂交涉及三大内容,：,制备杂交探针；制备被检的核酸或蛋白质样品；印迹及杂交。,第二节 外源基因整合的Southern杂交鉴定Souther,一、,Southern,杂交步骤,（一）植物总,DNA,提取,（二）杂交探针的制备,探针：,是经过特殊化合物标记的特定的核苷酸序列。,分为,DNA,探针和,RNA,探针，,DNA,探针又分为单链,DNA,探针和双链,DNA,探针。,杂交探针制备包括,：探针核苷酸序列的获取及标记两部分。,一、Southern杂交步骤（一）植物总DNA提取,鉴定转基因植株时应使用同源探针，常以转化的目的基因作探针。,目的基因探针一般从载体质粒上切取。包括质粒,DNA,的分离纯化；限制性内切梅切割；电泳分离酶切片段；从凝胶中回收目的片段。,1,、探针核苷酸序列的获取,1、探针核苷酸序列的获取,2,、探针标记,（,1,）理想的标记物条件：,标记前后探针的基本结构相同，标记物不影响探针的杂交特异性；,检测灵敏度高、特异性强、本底低、重复性好且操作简便、省时；,稳定、安全、无环境污染；,经济。,2、探针标记,标记物分为：,放射性和非放射性两类,放射性标记物主要有,32P,、,35S,、,125I,、,14C,等；,非放射性标记物主要有,生物素、地高辛、荧光素、辣根过氧化物酶等,.,标记物分为：放射性和非放射性两类,（,2,）放射性标记物,制备核酸探针时使用的放射性标记物多为三磷酸核苷酸（,NTP,）或脱氧三磷酸核苷酸（,dNTP,），以这些标记的核苷酸作底物，通过酶促聚合反应，使标记物掺入到多核苷酸链中，从而获得合适探针。,特点,：放射自显影灵敏度高，压片时间短；,分辨力较低；,探针不能长期保存,（2）放射性标记物,（,3,）非放射性标记物,特点：,敏感性较差；,稳定性好、分辨力高，检测所需时间短。对人和环境无害。,生物素,:,是一种水溶性,B,族维生素，其分子中的戊酸羧基经化学修饰可含有各种活性基团，它能与蛋白质、核酸等多种物质发生偶联，从而使这些物质被生物素标记。,（3）非放射性标记物,生物素标记的探针可通过生物素,-,抗生物素蛋白的亲和系统检出，也可通过生物素,-,抗生物素抗体的免疫系统检出。,抗生物素蛋白可与酶、荧光素等物质结合，是抗生物素蛋白被这些物质标记，杂交时，生物素标记探针与被检的单链,DNA,中同源序列杂交，检出时，加入被酶等标记物标记的抗生物素蛋白，生物素与被标记的抗生物素蛋白特异结合，形成杂交,DNA-,生物素,-,抗生物素,-,酶等标记物的杂交检出体系，根据抗生物素蛋白上的标记物性质进行检出。,生物素标记的探针可通过生物素-抗生物素蛋白的亲和系统检出，也,图,28-3,地高辛标记探针杂交体检出原理示意图,图28-3地高辛标记探针杂交体检出原理示意图,3,、标记方法,放射性标记有体内标记法及体外标记法。体外标记法包括化学法、酶法和,PCR,法,酶法：,是先将标记物标记在核苷酸上，然后通过酶促聚合反应使带标记的核苷酸掺入到核酸序列中，产生合适探针。,包括,切口平移法及随机引物法。,3、标记方法放射性标记有体内标记法及体外标记法。体外标记法包,PCR,法：,是利用,Taq,酶可将修饰的核苷酸掺入到,PCR,产物中（如,32P-dNTP,、地高辛,-dUTP,荧光素标记的,dNTP,）所得,PCR,产物可用作探针。,化学法：,是通过标记物的活性基团与核酸分子中的某种基团发生化学反应而继续标记，标记物直接与核酸分子相连。,PCR法：是利用Taq酶可将修饰的核苷酸掺入到PCR产物中（,28-4,切口平移法,28-4切口平移法,28-5,随机引物法,28-5随机引物法,三、,Southern,印迹杂交,程 序,1,、植物总,DNA,的限制酶切,2,、凝胶电泳分离酶切片段,3,、凝胶中的,DNA,变性,4,、印迹,：毛细转移法和电转移法,5,、杂交,6,、杂交信号的检出,三、Southern印迹杂交程 序,5,、杂交,1,）杂交体系：,探针浓度：控制在,0.5ng/ml,或更低,杂交反应温度：低于,Tm,值,15-25,杂交时间：,5、杂交1）杂交体系：,2,）预杂交及洗膜,杂交的特异性是影响杂交效果的重要因素，非特异性杂交的去除主要是通过杂交前的预杂交和杂交后的洗膜完成。,预杂交：,是在加入探针前用封闭剂封闭膜上的非特异性位点。,常用封闭剂包括,变性的非特异性,DNA,，如鲑鱼精子,DNA,，小牛胸腺,DNA,等；另一类是高分子化合物，如,Denhardts,操作,：将印迹后的固相膜放在含封闭剂的预杂交液中，,37-42,温育,3-12h,2）预杂交及洗膜,洗膜：,是杂交后将固相膜依次置于不浓度的溶液中漂洗，以除去游离的及非特异性位点上结合的探针。,洗膜液的温度、离子强度及洗膜时间是影响洗膜效果的三要素。,洗膜：是杂交后将固相膜依次置于不浓度的溶液中漂洗，以除去游离,6,、杂交信号的检出,放射性标记的探针通过放射自显影检出；,包括：感光材料曝光、显影、定影、水洗等过程。,非放射性标记的探针主要通过酶反应法检出,包括：偶联反应和酶的显色反应两阶段。,6、杂交信号的检出放射性标记的探针通过放射自显影检出；,二、外源基因整合的,PCR-Southern,检测,该方法是先对被检测材料进行外源基因的,PCR,扩增，然后再用目的基因的同源探针与扩增的特异性条带进行杂交。,注意,：,设置三个对照,空白对照：无任何,DNA,模板；,阳性对照：以外源基因的重组质粒,DNA,为模板；,阴性对照：以非转化植株基因组,DNA,为模板。,二、外源基因整合的PCR-Southern检测该方法是先对被,第三节 外源基因转录的,Northern,杂交检测,植物细胞总,RNA,的提取,探针的制备,印迹及杂交,第三节 外源基因转录的Northern杂交检测植物细胞总RN,外源基因表达的,RT-PCR,检测,外源基因表达的RT-PCR检测,第四节 外源基因表达蛋白的检测,外源基因表达蛋白检测主要利用免疫学原理，主要方法是,Western,杂交和,ELISA,一、,ELISA,检测,酶联免疫吸附法,（,ELISA,）是一种利用免疫学原理检查抗原、抗体的技术。,检测程序包括,：抗体制备、抗体或抗原的包被和免疫反应及检出,。,第四节 外源基因表达蛋白的检测外源基因表达蛋白检测主要利用免,1,、抗体的制备,抗体：,是机体应抗原刺激产生的一组特殊的球蛋白，,Ig,表示。,ELISA,检测中涉及的抗体有两种，未标记的抗体和酶标记的抗体，酶标记的抗体有包括两种：一是针对特异抗原的,酶标一抗,，一是针对一抗的,酶标二抗,。,1、抗体的制备,2,、包被,包被是将抗原或抗体固定在固相载体表面。常用的固相载体是多孔的聚苯乙烯微量反应板。,3,、免疫反应,4,、检出,2、包被,图,30-1,夹心法示意图,图30-1夹心法示意图,第十章-转基因植物的检测与鉴定课件,第十章-转基因植物的检测与鉴定课件,爱是什么？一个精灵坐在碧绿的枝叶间沉思。风儿若有若无。一只鸟儿飞过来，停在枝上，望着远处将要成熟的稻田。精灵取出一束黄澄澄的稻谷问道：“你爱这稻谷吗？”“爱。”“为什么？”“它驱赶我的饥饿。”鸟儿啄完稻谷，轻轻梳理着光润的羽毛。“现在你爱这稻谷吗？”精灵又取出一束黄澄澄的稻谷。鸟儿抬头望着远处的一湾泉水回答：“现在我爱那一湾泉水，我有点渴了。”精灵摘下一片树叶，里面盛了一汪泉水。鸟儿喝完泉水，准备振翅飞去。“请再回答我一个问题，”精灵伸出指尖，鸟儿停在上面。“你要去做什么更重要的事吗？我这里又稻谷也有泉水。”“我要去那片开着风信子的山谷，去看那朵风信子。”“为什么？它能驱赶你的饥饿？”“不能。”“它能滋润你的干渴？”“不能。”爱是什么？一个精灵坐在碧绿的枝叶间沉思。风儿若有若无。一只鸟儿飞过来，停在枝上，望着远处将要成熟的稻田。精灵取出一束黄澄澄的稻谷问道：“你爱这稻谷吗？”“爱。”“为什么？”“它驱赶我的饥饿。”鸟儿啄完稻谷，轻轻梳理着光润的羽毛。“现在你爱这稻谷吗？”精灵又取出一束黄澄澄的稻谷。鸟儿抬头望着远处的一湾泉水回答：“现在我爱那一湾泉水，我有点渴了。”精灵摘下一片树叶，里面盛了一汪泉水。鸟儿喝完泉水，准备振翅飞去。“请再回答我一个问题，”精灵伸出指尖，鸟儿停在上面。“你要去做什么更重要的事吗？我这里又稻谷也有泉水。”“我要去那片开着风信子的山谷，去看那朵风信子。”“为什么？它能驱赶你的饥饿？”“不能。”“它能滋润你的干渴？”“不能。”,爱是什么？一个精灵坐在碧绿的枝叶间沉思。风儿若有若无。,二、,Western,杂交,Western,杂交是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的蛋白质检测方法。,程 序：,植物蛋白质的提取,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质,蛋白质条带印迹,探针制备,杂交与检出,二、Western杂交Western杂交是将蛋白质电泳、印迹,第十章-转基因植物的检测与鉴定课件,第十章-转基因植物的检测与鉴定课件,其实，世上最温暖的语言，“不是我爱你，而是在一起。”所以懂得才是最美的相遇！只有彼此以诚相待，彼此尊重，相互包容，相互懂得，才能走的更远。,相遇是缘，相守是爱。缘是多么的妙不可言，而懂得又是多么的难能可贵。否则就会错过一时，错过一世！,择一人深爱，陪一人到老。一路相扶相持，一路心手相牵，一路笑对风雨。在平凡的世界，不求爱的轰轰烈烈；不求誓言多么美丽；唯愿简单的相处，真心地付