实验一质粒DNA的提取和鉴定课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,质粒,DNA,的提取和纯化,郑 敏,生化与分子生物学系,质粒DNA的提取和纯化 郑 敏,1,分子生物学,从,分子水平,上研究生命现象物质基础的学科。研究细胞成分的物理、化学的性质和变化以及这些性质和变化与生命现象的关系，如遗传信息的传递，基因的结构、复制、转录、翻译、表达调控和表达产物的生理功能，以及细胞信号的转导等。,分子生物学从分子水平上研究生命现象物质基础的学科。研究细胞成,2,基因工程,基因工程,3,移液器和,EP,管,移液器和EP管,4,质 粒,质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，,独立于染色体之外的、能自主复制的双链环状,脱氧核糖核酸,物质。,质粒的存在使宿主具有一些额外的特性，如对抗生素的抗性等。,F,质粒,(,又称,F,因子或性质粒,),、,R,质粒,(,抗药性因子,),和,Col,质粒,(,产大肠杆菌素因子,),等都是常见的天然质粒。,能稳定地,独立存在,于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。,现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的，常含抗生素抗性基因，是,重组,DNA,技术,中重要的工具。,质 粒质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，独立于染色体之,5,分类：,单拷贝质粒；,多拷贝质粒,；,紧密控制型；,松弛控制型；,分类：,6,实验一质粒DNA的提取和鉴定课件,7,质粒,DNA,的提取方法,碱裂解法；,煮沸裂解法；,酚氯仿抽提法；,概括起来主要是用非离子型或离子型,去污剂,、,有机溶剂或碱,进行处理及用,加热,处理。,质粒DNA的提取方法碱裂解法；概括起来主要是用非离子,8,基本思路,培养细菌使质粒扩增；,收集和,裂解细菌,；,分离质粒,DNA,(,有时还要求纯化质粒,DNA,，根据实验所需,),电泳检测；,基本思路培养细菌使质粒扩增；,9,碱裂解法的基本原理,十二烷基磺酸钠,(SDS),可使,细胞膜裂解,。,经,SDS,处理后，细菌染色体,DNA,会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体,DNA,比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。,当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性,染色体,DNA,变性,，而共价闭合环状,DNA(Covalently closed circularDNA,，简称,cccDNA),的两条链不会相互分开。,当外界条件恢复正常时，线状染色体,DNA,片段难以复性，而是与,变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起,，而质粒,DNA,双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。,碱裂解法的基本原理十二烷基磺酸钠(SDS)可使细胞膜裂解。,10,实验步骤,1,、将含有质粒,DNA,的细菌在,LB,培养基中培养过夜。取,1.5ml,LB,培养液,倒入,1.5mleppendorf,管中，,4,下,12000g,离心,30,秒。,2,、弃上清，将管倒置于卫生纸上数分钟，使液体流尽。,3,、菌体沉淀重悬浮于,100l,溶液,中（需剧烈振荡）。,4,、加入新配制的,溶液,200l,，盖紧管口，快速温和颠倒,eppendorf,管数次，以混匀内容物（千万不要振荡），冰浴,2,分钟。,5,、加入,150l,预冷的,溶液,，盖紧管口，颠倒混匀，冰浴中,5,分钟，,4,下,12000g,离心,10,分钟。,6,、上清液,（,450uL,）,移入干净,eppendorf,管中，加入,等体积的饱和酚,（,1:1,），充分颠倒混匀，,4,下,12000g,离心,10,分钟。,实验步骤1、将含有质粒DNA的细菌在LB培养基中培养过夜。取,11,7,、将水相,（,400uL,）,移入干净,eppendorf,管中，加入,等体积酚,/,氯仿,，颠倒混匀，,12000rpm,离心,10min,。,8,、将水相,（,350uL,）,移入干净,eppendorf,管中，加入,2,倍体积的无水乙醇,，振荡混匀后置于,-20,冰箱中,20,分钟，然后,4,下,12000g,离心,10,分钟。,9,、弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入,0.5ml,70,乙醇,洗沉淀一次，,4,下,12000g,离心,5-10,分钟。,10,、吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干燥,10,分钟或室温干燥。,11,、将沉淀溶于,10l TE,缓冲液（,pH8.0,，含,20g/ml,RNaseA,）中，储于,-20,冰箱中。,7、将水相（400uL）移入干净eppendorf管中，加入,12,LB,液体培养基（,Luria-Bertani,）,称取蛋白胨（,Tryptone,）,10g,，酵母提取物（,Yeastextract,）,5g,，,NaCl10g,，溶于,800ml,去离子水中，用,NaOH,调,pH,至,7.5,，加去离子水至总体积,1,升，高压下蒸气灭菌,20,分钟。,LB液体培养基（Luria-Bertani）称取蛋白胨（Tr,13,溶液,I,50mmol/L,葡萄糖，,25mmol/L T r i s.Cl,（,pH8.0,），,10mmol/L,EDTA,（,pH8.0,）。,溶液,可成批配制，每瓶,100ml,，,高压灭菌,15,分钟，储存于,4,冰箱,溶液,I,：重悬细菌；,葡萄糖：比重大，使细菌不易沉淀；,Tris,HCl,：缓冲体系；,EDTA,：螯合金属离子；,溶液I50mmol/L葡萄糖，25mmol/L T r i,14,溶液,0.2mol/L,NaOH,（,临用前用,10mol/LNaOH,母液稀释），,1,SDS,溶液,II,破膜，变性基因组,DNA,和蛋白质；,SDS,破膜作用，变性蛋白质；,NaOH,破膜，变性基因组,DNA,；,溶液0.2mol/LNaOH（临用前用10mol/LNa,15,溶液,5mol/LKAc60ml,，,冰醋酸,11.5ml,，,H2O 28.5ml,，,定容至,100ml,，,并高压灭菌。溶液终浓度为：,K+3mol/L,，,Ac5mol/L,。,溶液,III,中和溶液，复性质粒,DNA,；,溶液5mol/LKAc60ml，冰醋酸11.5ml，H2O,16,酚,/,氯仿（,1:1,）,酚,变性蛋白质；,氯仿,萃取溶液中的酚；,分为两层，上层为水层，下层为酚氯仿混合液。吸取时不要震荡。,酚/氯仿（1:1）酚变性蛋白质；分为两层，上层为,17,乙醇,无水乙醇（,2,倍体积）,沉淀质粒,DNA,；,70%,乙醇,洗涤质粒,DNA,沉淀，除去沉淀中的盐分；,乙醇无水乙醇（2倍体积）沉淀质粒DNA；,18,实验一质粒DNA的提取和鉴定课件,19,核酸的定量,260 nm,，,1OD,值相当于：,双链,DNA,浓度为,50,g/ml,单链,DNA,浓度为,40,g/ml,A260/A280=1.8,（,DNA,）,A260/A280=2.0,（,RNA,）,核酸的定量260 nm，1OD值相当于：,20,电 泳,Electrophoresis,电 泳 Electrophores,21,一、定义,电泳带电粒子在直流电场中向着电性相反电极移动的现象。,电泳分析技术利用电泳现象进行物质分离的技术。,一、定义电泳带电粒子在直流电场中向着电性相反电极移动的,22,二、电泳分析技术发展概况,1809年 发现电泳现象,1937年,Tiselius,自由界面电泳,1948年,Wieland,滤纸电泳,1980年,毛细管电泳,(capiliary electrophoresis,),二、电泳分析技术发展概况 1809年 发现电泳现象,23,三、电泳分析技术的分类,1.根据被分离样品的量多少,分析电泳,制备电泳,2.根据电泳电压的高低,常压电泳 0500,V,高压电泳 5003000,V,3.根据电泳中是否使用支持物,自由电泳不使用支持物，在溶液中进行。,区带电泳使用支持物,三、电泳分析技术的分类1.根据被分离样品的量多少,24,4.,按支持物的物理性状不同,滤纸及其他纤维薄膜电泳,，,如醋酸纤维素、玻璃纤维、聚氯乙烯纤维,凝胶电泳,，,如琼脂、琼脂糖、硅胶、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳,粉末电泳，,纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳,丝状电泳,，,如尼龙丝、人造丝电泳,4.按支持物的物理性状不同滤纸及其他纤维薄膜电泳，如醋酸纤,25,5.,按支持物的装置形式不同,平板式电泳,垂直板式电泳,垂直柱式电泳,5.按支持物的装置形式不同,26,6,.根据电泳系统,pH,是否连续,连续,pH,电泳指电泳过程中,pH,保持不变；,不连续,pH,电泳指电极缓冲液和电泳支持物的不同区段也有不同的,pH,；,6.根据电泳系统pH是否连续,27,电泳技术的特点,:,凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分离,并可进行定性或定量分析,;,样品用量极少,;,设备简单,;,可在常温进行,;,操作简便省时,;,分辨率高,.,电泳技术的特点:凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分离,并,28,四、电泳的基本原理,一个分子，如能解离或能吸附带电质点，在电场中便会向正极或负极移动。,四、电泳的基本原理一个分子，如能解离或能吸附带电质点，在电场,29,移动速度,以蛋白质分子为例:,F=EQ,（Q：,有效电荷,;E：,电位梯度）,F,=6,r,v,（F：,摩擦阻力,;v：,在介质粘度,中半径为,r,的颗粒的移动速度）,F=F,EQ=6,r,v,E Q,v=,6,r,移动速度以蛋白质分子为例:F=EQ,30,迁移率,（,Mobility),带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。,V Q,M=,E 6,r,迁移率（Mobility)带电颗粒在单位电场,31,五、影响电泳速度的因素,1.电场强度（,E）,E,电流热效应支持介质上的水分蒸发样品的热变性,E,电泳速度慢延长电泳时间样品扩散区带模糊不清分辨率下降,2.,带点颗粒的半径,r,阻力,电泳速度变慢,3.,支持物介质,吸附作用；电渗作用；分子筛作用,缓冲液,离子强度（,I）,：,I,缓冲能力越大缓冲液所载的分电流增加，而样品所载的电流相应减少电泳速度减慢,pH,：,pH,值决定了化合物解离的程度，也决定了质点所带的净电荷。,五、影响电泳速度的因素1.电场强度（E）,32,电泳,在一定电场强度下，,DNA,分子的迁移取决于分子筛效应，即,DNA,分子本身的,大小,和,构型,(,相对分子质量不同的,DNA,片段泳动速度不一样,),，且,DNA,分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。,凝胶电泳,不仅可分离,不同相对分子质量,的,DNA,，也可以,分离相对分子质量相同，但构型不同的,DNA,分子。,电泳在一定电场强度下，DNA分子的迁移取决于分子筛效应，即D,33,琼脂糖凝胶,从琼脂中除去带电荷的琼脂胶后，剩下的不含磺酸基团、羧酸基团等带电荷基团的中性部分，结构是链状的聚半乳糖，易溶于沸水，冷却后可依靠糖基间的氢键引力形成网状结构的凝胶。,凝胶的网孔大小和凝胶的机械强度取决于琼脂糖浓度。因此琼脂糖凝胶可作为,分子筛,，常用于,凝胶层析和电泳,。,琼脂糖凝胶从琼脂中除去带电荷的琼脂胶后，剩下的不含磺酸基团、,34,电泳鉴定,其中,超螺旋结构,泳动最快；,其次为,线性结构；,最慢的可能是,复制中间体,（没有复制完的两个质粒连在一起）；,电泳鉴定其中超螺旋结构泳动最快；,35,染料,EB,溴化乙锭（,EB,）是一种荧光染料,(3,8-,二氨基,-5-,乙基,-6,苯基菲啶溴盐,),，其分子可以嵌入到核酸的碱基对之间，在紫外线的激发下，发出橙色荧光。,染料EB溴化乙锭（EB）是一种荧光染料(3,8-二氨基-,36,实验一质粒DNA的提取和鉴定课件,37,注意,EB,是诱变剂，配制和使用,EB,染色液时，应带乳胶手套或一次性手套，并且不要将该染色液洒在桌面或地面上，凡是沾污,EB,的器皿或物品，必须进行清洗或弃去。,注意EB是诱变剂，配制和使用EB染色液时，应带乳胶手套或一次,38,实验一质粒DNA的提取和鉴定课件,3