蛋白质重要性质

第四节 蛋白质的重要性质,四.蛋白质的重要性质,(一)胶体性质,蛋白质的分子量1万-100万之间，其分子直径1-100,nm,之间，在胶体颗粒的范围。,蛋白质的水溶液是一种比较稳定的亲水胶体，这是因为在蛋白质颗粒表面带有很多极性基团，如,NH,3,、,COO,-,、,OH,-,、,SH、,CONH,2,等和水有高度亲和性，当蛋白质与水相遇时，就很容易在蛋白质颗粒外面形成层水膜。,所以蛋白质具有胶体性质，如,布朗运动,、,光散射,、,电泳,、,不能透过半透膜,及,具有吸附能力,等,。利用蛋白质不能透过半透膜的性质，可用羊皮纸、火棉胶、玻璃纸等来分离纯化蛋白质，这个方法称,透析（,dialysis）。,四.蛋白质的重要性质,(一)胶体性质,(二)两性解离及等电点,蛋白质同氨基酸一样也是两性电解质，即能和酸作用，也能和碱作用。蛋白质分子中可解离的基团除肽链末端的,-氨基和,-羧基外，主要还是多肽链中氨基酸残基上的侧链基团如,-氨基、,-羧基、,-羧基、咪唑基，胍基、酚基、疏基等。在一定的,pH,条件下，这些基团能解离为带电基团从而使蛋白质带电。,四.蛋白质的重要性质,蛋白质的等电点,（,pI）：,当某蛋白质在一定的,pH,的溶液中，所带的正负电荷相等，它在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的,pH,值叫做该蛋白质的等电点。,酸性蛋白、碱性蛋白,蛋白质的带电性质与溶液的,pH,有关。利用蛋白质的两性解离可以通过电泳分离纯化蛋白质。,四.蛋白质的重要性质,(二)两性解离及等电点,蛋白质受到某些理化因素的影响，其空间结构发生改变，蛋白质的理化性质和生物学功能随之改变或丧失，但未导致蛋白质一级结构的改变，这种现象叫,变性作用,（,denaturation）,。,1.蛋白质变性的概念,2.蛋白质变性的因素,物理因素,：加热、紫外线、超声波、高压等；,化学因素,：强酸、强碱、脲、盐酸胍、去垢剂、重金属盐等；,(三)蛋白质的变性,四.蛋白质的重要性质,生物活性丧失（酶）；,溶解度降低，粘度增大，扩散系数变小（蛋清）；,基团位置改变；,对蛋白酶敏感性增大。,3.蛋白质变性后的表现,四.蛋白质的重要性质,(三)蛋白质的变性,4.蛋白的复性,蛋白质的变性作用若不过于剧烈，则是一种可逆过程。高级结构松散了的变性蛋白质通常在除去变性因素后，可缓慢地重新自发折叠形成原来的构象，恢复原有的理化性质和生物活性，这种现象称为,复性(,renaturation)。,大多蛋白质变性后，很难复性。,四.蛋白质的重要性质,(三)蛋白质的变性,(四)蛋白质的沉淀,加入适当试剂使蛋白质分子处于等电点状态或失去水化层，蛋白质的胶体溶液就不稳定,并将产生沉淀。,能使蛋白质沉淀的试剂有：,1.,高浓度中性盐,（NH,4,),2,SO,4、,Na,2,SO,4,、NaCl,（,中和蛋白质的电荷）,这种加入盐使蛋白质沉淀析出的现象称为,盐析,，用于蛋白质分离制备。,2.有机溶剂,丙酮、乙醇,(破坏蛋白质水膜),四.蛋白质的重要性质,3.重金属盐,Hg,2+,、Ag,+,、Pb,+,（,与蛋白质中带负电基团形成不易溶解的盐,或改变蛋白质的空间结构,）,4.,生物碱试剂,苦味酸、目酸、钨酸等,（与蛋白质中带正电荷的基团生成不溶性盐）,四.蛋白质的重要性质,(四)蛋白质的沉淀,(五),蛋白质的颜色反应,1.,双缩脲反应,双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物。双缩脲在碱性溶液中能与硫酸铜反应产生红紫色络合物，此反应称双缩脲反应。蛋白质分子中含有许多和双缩脲结构相似的肽键，因此也能起双缩脲反应。通常可用此反应来定性鉴定蛋白质，也可根据反应产物的颜色深浅在,540,nm,处进行蛋白质的定量测定。,四.蛋白质的重要性质,2.,酚试剂（,Folin-,酚试剂）反应,蛋白质分子中一般都含有酪氨酸，而酪氨酸中的酚基能将,Folin-,酚试剂中的磷钼酸及磷钨酸还原成蓝色化合物（即钼蓝和钨蓝的混合物）。这一反应常用来定量测定蛋白质含量。,可根据反应产物的颜色深浅在,540,nm,处进行蛋白质的定量测定.,四.蛋白质的重要性质,(五),蛋白质的颜色反应,3.,茚三酮反应,由于蛋白质多肽链两端有游离的,-,NH,2,和,-,COOH，,所以蛋白质也可以和茚三酮发生反应。,4,.考马斯亮兰,与蛋白质反应形成蓝色透明物质，在595,nm,下进行比色。,四.蛋白质的重要性质,(五),蛋白质的颜色反应,(六),蛋白质的,的分离、纯化与鉴定,1.蛋白质分离、纯化的过程和一般原则,（1）前处理（,Pretreatment,）-,细胞破碎，蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来。,（2）粗分级（,Rough fractionation,）,当蛋白质混合物的提取液获得后，选用一套适当分离纯化方法，使目的蛋白与大量的杂蛋白分离开。,四.蛋白质的重要性质,1,.,蛋白质分离、纯化的过程和一般原则,（3）细分级（,Fine fractionation,）,是将样品进一步提纯的过程。样品经粗分级以后，一般体积较小，杂蛋白已经大部分被除去。,（4）结晶（,Crystal,）,由于结晶中从未发现过变性蛋白质，因此蛋白质的结晶不仅是纯度的一个标志，也是断定制品处于天然状态的有力指标。蛋白质纯度愈高，溶液愈浓就愈容易结晶。,四.蛋白质的重要性质,(六),蛋白质的,的分离、纯化与鉴定,2.,蛋白质分离纯化的一般方法,（1）根据蛋白质分子大小不同的分离方法,透析和超滤 透析（,dialysis,）,和超滤（,ultrafiltration,）,四.蛋白质的重要性质,(六),蛋白质的,的分离、纯化与鉴定,2.,蛋白质分离纯化的一般方法,（1）根据蛋白质分子大小不同的分离方法,b.,密度梯度（区带）离心,c.,凝胶过滤（,gel filtration,）,四.蛋白质的重要性质,(六),蛋白质的,的分离、纯化与鉴定,四.蛋白质的重要性质,葡聚糖凝胶过滤,2.,蛋白质分离纯化的一般方法,（2）,根据蛋白质溶解度的差异进行分离的方法,等电点沉淀（,isoelectric,precipitation）,蛋白质的盐溶和盐析,有机溶剂分级分离,四.蛋白质的重要性质,(六),蛋白质的,的分离、纯化与鉴定,2.,蛋白质分离纯化的一般方法,（3）根据蛋白质电荷不同的分离方法,电泳-在电场中，带电颗粒向着与其带相反电荷的电极移动，这种现象称电泳（,electrophoresis）。,四.蛋白质的重要性质,(六),蛋白质的,的分离、纯化与鉴定,影响迁移率的因素：电位梯度,电流密度,导电性,环境,pH（,分子电荷）,离子强度,分子的大小、形状,根据电泳的原理和影响因素可以设计不同的电泳方法以达到预期的目的,四.蛋白质的重要性质,按分离的原理分：区带电泳,移界电泳,等速电泳,等电聚焦,按有无支持物分：自由电泳,支持物电泳,四.蛋白质的重要性质,第一代固体介质：,纸，醋酸纤维素薄膜，硅胶等,第二代固体介质：,淀粉，聚丙烯酰胺（多用于蛋白质），琼脂糖（多用于核酸分离）,四.蛋白质的重要性质,聚丙烯酰胺的结构和特点,单体：丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺,增速剂：,TEMED（N,N,N,N-,四甲基乙二胺）、3-二甲胺丙腈,引发剂：过硫酸铵、过硫酸钾、核黄素,特性：机械性能、弹性、透明度、粘着度、孔径大小,电泳原理：,1.最主要的特性是蛋白质的带电行为，产生电荷效应,2.分子筛效应,3.,分子形状,四.蛋白质的重要性质,2.,蛋白质分离纯化的一般方法,四.蛋白质的重要性质,(六),蛋白质的,的分离、纯化与鉴定,（3）根据蛋白质电荷不同的分离方法,b.,离子交换层析（,ion-exchange chromatography）,四.蛋白质的重要性质,(六),蛋白质的,的分离、纯化与鉴定,2.,蛋白质分离纯化的一般方法,（3）根据蛋白质电荷不同的分离方法,亲和层析法,（,affinity chromatography）,四.蛋白质的重要性质,(六),蛋白质的,的分离、纯化与鉴定,3.,蛋白质,分子量的测定方法,凝胶过滤测定蛋白质的分子质量,凝胶过滤层析法（,gel filtration chromatography）,或称为分子排阻层析（,size exclusion）,或分子筛层析（,molecular sieve chromatography）,能够测定完整的蛋白质分子质量,四.蛋白质的重要性质,(六),蛋白质的,的分离、纯化与鉴定,3.,蛋白质,分子量的测定方法,(2),SDS（,十二烷基硫酸钠）,-PAGE,测定蛋白质分子量,四.蛋白质的重要性质,(六),蛋白质的,的分离、纯化与鉴定,2.,蛋白质,分子量的测定方法,(,3)毛细管电泳测定蛋白质的分子质量,毛细管电泳（,CE）,则可以在很大程度上克服常规方法时间长、灵敏芽低不利情况。用毛细管电泳测定蛋白质分子量仅需要纳克量蛋白质，而且还可以用积分仪或电脑联机精确定量。,四.蛋白质的重要性质,(六),蛋白质的,的分离、纯化与鉴定,2.,蛋白质,分子量的测定方法,(4)质谱测定蛋白质分子量,质谱测定蛋白质分子量是近年来发展的一项新技术，其分辨率和精确度都较前几项技术高。尤其近几年发展起来的磁质谱可精确测定分子质量2000,Da,以下的多肽；而电喷雾质谱（,ESI）,可以测5万,Da,的蛋白质，而且只需要皮摩尔（,pmol）,量的蛋白质，精确度为0.01%。,四.蛋白质的重要性质,(六),蛋白质的,的分离、纯化与鉴定,本章结束,