药代动力学实验培训课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,药代动力学实验,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,药代动力学实验,*,药代动力学实验,神农尝百草,传说神农一生下来就是个“水晶肚”，几乎是全透明的，五脏六腑全都能看得见，还能看得见吃进去的东西。那时候，人们经常因乱吃东西而生病，甚至丧命。神农为此决心尝遍百草，能吃的放在身体左边的袋子里，介绍给别人吃；不好吃的就放在身体右边袋子里，作药用。不能吃的就提醒人们注意。,2,药代动力学实验,3,生物样品,药物代谢动力学,定量研究药物（包括外来化学物质）在生物体内吸收、分布、排泄和代谢（简称体内过程）规律的一门学科。,常用测,定方法,HPLC-UV?,GC-MS?,LC-MS/MS?,数据处理分析,药代动力学实验,1.HPLC,原理与标准操作规程,(SOP),2.,实验设计与动物实验,3.,样品处理与方法开发,4.,定性定量与分析测定,5.,数据处理与药动学参数计算,6.,实验报告,实验安排,静注加替沙星在家兔体内的药代动力学研究,4,药代动力学实验,HPLC,原理与标准操作规程,(SOP),1.HPLC,的组成,2.,分配色谱的原理,3.,色谱柱,4.,流动相,5.,定性与定量方法,6.,样品的预处理,7.,反相色谱分析方法的开发,5,药代动力学实验,High Performance Liquid Chromatography HPLC,的组成,Pump,泵,Injector/Autosampler,进样器,/,自动进样器,Column,色谱柱,Detector,检测器,Data System/Integrator,数据系统,/,积分仪表,6,药代动力学实验,高效液相色谱系统,7,药代动力学实验,高效液相色谱系统,SHIMADZU,LCMS,-2010EV,LC-MS/MS,Thermo TSQ Quantum Access,8,药代动力学实验,分配色谱的分离机理,9,药代动力学实验,分配色谱概述,反相色谱的主要类型，基于分子的极性分离,洗脱次序：一般为反相，即极性高的先被洗脱,常用的流动相：,有机溶剂如甲醇、乙腈，水,应用添加剂，成为离子对、离子抑制方法,常用固定相：,碳十八、碳八、胺基等基团,反相色谱固定相多为键合相,10,药代动力学实验,对,HPLC,柱的了解,色谱柱分类,填料，含碳量，基质，粒径,色谱柱的应用,正相柱，反相柱，预处理柱,色谱柱的规格,岛津,Shimadzu VP-ODS;150L,2.0;5m;,柱号 8082693.,11,药代动力学实验,键合相色谱柱,以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、碳八、胺基等基团联在基质上，作为固定相。,优点,固定相稳定，不易流失,应用广泛，可使用多种溶剂,消除硅羟基的不良影响,缺点,pH,值不能小于,3,同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同,12,药代动力学实验,反相,C18,色谱柱的活化,步骤一：,90%,甲醇,1mL/min,流速冲洗,30min,步骤二：,10%,甲醇,1mL/min,流速冲洗,30min,步骤三：,90%,甲醇,1mL/min,流速冲洗,60min,13,药代动力学实验,色谱柱的存放,存放前的处理,除去杂质、盐,合适的存放溶剂,避免色谱柱床的干枯,避免机械震动,防止细菌生长,注意存放的温度,14,药代动力学实验,液相色谱对流动相的要求,除色谱柱对流动相对的要求外，还有,与检测器匹配,脱气,避免卤素离子（不锈钢系统）,溶剂的粘度,细菌的生长,15,药代动力学实验,流动相的脱气,流动相脱气的目的,使色谱泵的输液准确,输液均匀准确，并且脉动减小,保留时间及色谱峰面积的重现性提高,提高检测的性能,防止气泡引起的尖峰,基线稳定，信噪比增加,溶剂的紫外吸收本底降低,保护色谱柱,减少死体积,防止填料的氧化,16,药代动力学实验,流动相脱气的方法,加热,简单，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流动相组成的变化,抽真空,同上，一般在溶剂抽滤的同时，也有脱气的效果,超声波,简单，但效果不理想。,通惰性气体（一般用氦气）,可保持连续脱气，多用于低压梯度,脱气机,可保持连续脱气，多用于低压梯度,17,药代动力学实验,色谱峰定性,鉴别每个色谱峰,通过比较保留值,(,通常是,保留时间,),的方法，找到各色谱峰所对应的组份,大多数情况下用比较保留时间来定性,即所谓：,保留时间相同，可能是同样的组份,保留时间不同，肯定不是同样的组份,18,药代动力学实验,用保留时间定性,用“标样”的保留值定出被测组份的位置,19,药代动力学实验,标准加入法举例,废水样品中五氯苯（,PCP,）的分析,PCP,4 ppm,3 ppm,2 ppm,1 ppm,20,药代动力学实验,常用的定量方法,峰面积百分比法,由于检测技术的影响，在液相色谱中不常用,外标法,在液相色谱中用的最多,内标法,准确，但是麻烦,在标准方法中用的最多,21,药代动力学实验,外标法定量,配制一系列已知浓度的标样,22,药代动力学实验,外标法定量（二）,实际色谱图,标准曲线,23,药代动力学实验,内标法定量（一）,配制一系列浓度的标样，其中加有内标样,24,药代动力学实验,内标法定量（二）,实际色谱图,标准曲线,25,药代动力学实验,内标法定量（三）,对内标物的要求,化学结构与待测组分相似,(,同系物、异构体,),在样品中不存在,不与样品中组份发生任何化学反应,保留值与待测组分接近,浓度（响应值）与待测组分相当,其色谱峰与其他色谱峰分离好,26,药代动力学实验,可接收的检测范围,校正曲线只有在建立这条曲线的浓度范围内有效，高或低于这些点都可能引起计算错误,27,药代动力学实验,样品的预处理,样品预处理的目的,除去微粒,减少干扰杂质,浓缩微量的组份,提高检测的灵敏度及选择性,改善分离的效果,有利于色谱柱及仪器的保护,28,药代动力学实验,样品的预处理重要性,占样品分析时间的比例,样品预处理所用时间远大于色谱分离的时间,占分析的消耗总成本最大,消耗大量的溶剂及其他化学品,实验的重复性及准确性最差的环节,影响实验结果好坏的最重要因素,是决定性的步骤,29,药代动力学实验,样品预处理常用的方法,高速离心,过滤、超滤,选择性沉淀,衍生反应,液,-,固萃取,/,液,-,液萃取,Sep-Pak,样品处理小柱,其他,30,药代动力学实验,样品分析时第一步干什么,?,想办法得到各种信息,向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析方法,查文献，如,CA(,化学文摘,),仪器制造商的文献，如,Waters,对色谱柱有足够的了解,掌握分离机理，自己开发方法,充分了解您自己的样品,32,药代动力学实验,分析时要了解哪方面的情况？,灵敏度的要求有多高,?,样品的本底是否很复杂,?,有多少组份要分析,?,对分析的精确度、准确度等有多高要求,?,是否因是日常检验，而要求方法容易使用,?,33,药代动力学实验,使用文献方法,色谱柱填料的种类、品牌是否相同,?,注意文献方法的流动相,是否损害色谱柱,?,如色谱填料品牌不同，需要调整流动相,注意色谱柱的规格：内径、柱长,需要调整流速、进样量,注意梯度条件,了解系统的滞后体积（梯度）,34,药代动力学实验,反相色谱的方法开发,开发过程实例,色谱条件,色谱柱：,C18,，,4mm30mm,流动相：乙腈,/,水，不同的溶剂强度，,60/40,、,50/50,、,40/60,，由强渐弱,流速：,2ml/min,样品：,对羟基苯甲酸甲酯,(Methyl Paraben),对羟基苯甲酸丙酯,(Propyl Paraben),对羟基苯甲酸丁酯,(Butyl Paraben),35,药代动力学实验,改变流动相比例,谱图,36,药代动力学实验,改变流动相组成,通过改变流动相改变选择性,同样强度的不同溶剂,改变色谱柱,37,药代动力学实验,离子型化合物的分离方式,使用离子交换柱离子交换法,主要用于“强”阴、阳离子,使用反相柱,离子抑制色谱法,通过改变流动相的,pH,值，使样品成中性,离子对色谱法,加入“对离子”，使样品呈中性,38,药代动力学实验,离子抑制色谱,离子型化合物在反相色谱柱上不保留,改变流动相的,pH,值，抑制样品离子的电离,适用于弱酸性化合物的分离,降低流动相的,pH,值，使样品降低离子化,使用硅胶基质,C,18,填料,使用条件应在填料基质的范围内,硅胶柱的,pH,在,2-8,（较保险值,3-7,）内,39,药代动力学实验,常用缓冲液及其,pH,值,40,药代动力学实验,离子抑制色谱实例,在乙腈,/,水及,pH=7,时，多数保留时间很短，无法完全分离。,41,药代动力学实验,其他精密仪器操作标准操作规程,(SOP),要点,高速冷冻离心机：,配平、,十字交叉,、样品选择,普通离心机：,配平、十字交叉、样品选择,万分之一电子天平：,称量量程范围、记录、保养,紫外可见光分光光度计：,预热、样品量、校准,涡旋振荡器：,涡旋程度,超声机：,超声效果、时间,42,药代动力学实验,药代动力学实验室的要求,1.,环境的要求：灰尘、湿度、阳光是分析仪器的大敌,2.,所写即所做,3.,分析测定用试剂为色谱纯及以上，水为超纯水,4.,痕量分析对实验人员有较高要求,5.,对仪器设备的操作严格按照,SOP,执行，专人管理和 维护保养,6.,良好的实验习惯,43,药代动力学实验,HPLC-UV,测定加替沙星的血药浓度如何着手？,查文献：中国优秀期刊论文数据库、,pubmed,需要关注的问题：色谱柱的选择,流动相的组成,柱温箱的温度,样品处理方法,检测器的波长,定量下限和标准曲线范围,44,药代动力学实验,静注,加替沙星,在,家兔,体内,药代动力学,如何着手？,查文献：中国优秀期刊论文数据库、,pubmed,实验设计需要考虑的问题：种属,给药剂量,取血时间,采样量,血药浓度大概范围,45,药代动力学实验,谢谢！,46,药代动力学实验,