兰州地区HCV-基因变异与干扰素-α应答关系的探讨

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,兰州地区HCV 基因变异与干扰素-应答关系的探讨,兰州市其次人民医院感染科,李丽,2023年11月,干扰素-interferon-,IFN-有抗病毒免疫调整及诱导细胞凋亡等作用，为目前治疗丙型肝炎病毒hepatitis C virus,HCV)感染的主要药物，然而有相当局部患者经IFN-系统治疗后不能获得长久的病毒转阴。,临床试验证明聚乙二醇化干扰素-长效干扰素-)180g/w，在48周时，病毒阴转率到达60%，而一般干扰素-的阴转率仅19%，聚乙二醇化干扰素-联合利巴韦林持续病毒应答率sustained virological response,SVR达81%。,争论显示长效干扰素-也有20%40%的肝炎患者存在复发和无应答状态，认为这种病例与基因变异和不同基因型的混合感染有关，为证明丙型肝炎病毒(HCV)5-NCR基因变异是否与干扰素-应答有关，我们对40例1b型患者及9例干扰素-治疗患者进展了HCV 5-NCR基因变异争论。,已有大量的争论资料证明，5-NCR变异与基因型相关，1型-6型之间有型特异变异特征和型特异酶切位点。我们承受1-6型通用引物扩增HCV cDNA，即可用于定性检测HCV RNA，又可用于检测基因型和1b型5-NCR基因变异，探讨5-NCR变异与干扰素-治疗免疫应答的关系。,现将40例1b型 5-NCR变异检测结果和9例干扰素-治疗患者的5-NCR变异检测结果汇报如下：,材料和方法,一、材料,1.40例HCV RNA阳性1b型血清，2023-2023年期间收集，-70保存。9例干扰素-治疗系列血清为2023-2023年期间收集。,2.限制性内切酶：BsrBI、Hinf I、Hae、BstU I、Apo I、BamH I、Mbo I 均为Biolabs产品。,3.HCV 5-NCR PCR扩增引物序列，依据孙南雄报道的序列合成。,材料和方法,一、材料,4.HCV 1b 全基因参考序列，见以下美国NCBI GenBank资料。,AB049088、AF165049、AF165050、AF165051、AF165052、AF165054、AF165059、AF165060、AF165061、AF165062、AF165063、AF165064、D50480、D50481、D50482、D50483、D50484、D50485、D10750、D11168、D90208、M58335、S62220、AF165055、AF165056、AF165057、D85516、AB080299、D14853、AF054247、AF054248、AF054249、AJ132996、AJ132997、AJ238799、AF483269、AF139524，D10934、L02836、AY460204，为中国1b型全基因株。,材料和方法,二、方法,1.分型方法：承受文献的HCV 5NCR酶切分型法，对HCV RNA阳性血清分型后，选取HCV 1b型样品检测HCV 5-NCR变异。,2.BamH 和Mbo酶切方法，取产物3ul，BamH或Mbo 5个单位，10buffer 2ul，灭菌水15ul，总体积20ul，37酶切2小时。,3.HCV 5-NCR基因变异株的检测，或2%琼脂糖胶均可。HCV 5-NCR基因变异的推断标准：在257bp的PCR产物中，仅有Mbo 单切点为野生株，产生2个Mbo 切点或无Mbo切点及产生BamH 切点或局部有切点、局部无切点均判为变异株。,材料和方法,二、方法,4.干扰素-治疗剂量：一般干扰素-即IFN-2b，安福隆公司生产，300MU隔日一针，疗程为一年。长效干扰素-PEG-IFN-2a，派罗欣，上海罗氏生产，135、180或270ug，一周一次，疗程为一年。,5.利巴韦林：全部患者均联合使用利巴韦林利巴韦林量依据患者体重计算，10-15mg/kg/d，治疗过程中监测血红蛋白及其他不良反响。,6.HCV RNA荧光定量试剂：上海实业科华生物技术的HCV核酸扩增荧光定量试剂盒，按说明书操作。,结 果,40例HCV 1b基因型患者5NCR基因变异检测结果：,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 M 15 16,-100bp,图1.1-16为HCV1b型 5NCR 257bp扩增产物3 微升电泳结果，M为,100bp 200bp 300bp 400bp 500bp分子标志物,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 M,-100bp,图2.1-16为HCV1b型 5NCR 257bp扩增产物，Mbo I酶切，电泳结果，M为100bp 200bp 300bp 400bp 500bp分子标志物，1，3，4，8，9，10，11，12，13，15有单一的Mbo I酶切点，产生154bp，103bp两个片段，5，14无Mbo I酶切点，仍保持257bp大小，2，6，7有Mbo I酶切点和无Mbo I酶切点同时在存在，16有2个Mbo I酶切点。,17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 30 32 M,-100bp,图3.17-32为HCV1b型 5NCR 257bp扩增产物，Mbo I酶切，电泳结果，M为100bp 200bp 300bp 400bp 500bp分子标志物，18，20，21，22，23，24，25，28，29，30，32有单一的Mbo I酶切点，产生154bp，103bp两个片段，27，30无Mbo I酶切点，仍保持257bp大小，17，26，有Mbo I酶切点和无Mbo I酶切点同时在存在，19有2个Mbo I酶切点。,2.,干扰素-治疗丙型肝炎患者5NCR变异检测结果,为了进一步了解干扰素-治疗丙型肝炎临床疗效与基因变异的关系，对9例干扰素-治疗患者的系列血清进展HCV 5-NCR变异的争论。9例中，除病例7和病例8仅使用一般干扰素-之外，其余7例均因一般干扰素-无效改用长效干扰素-联合利巴伟林抗病毒治疗。病例1-5干扰素-治疗有效患者中，2例为2a型，3例为1b，病例6-9干扰素-治疗无效患者中，l例为2a与1b混合型，3例为1b型。结果说明，在抗干扰素-病例中，在-221位均无MboI切点。,病 例,病例1，女，50岁，2023-6-16开头以一般干扰素-300MU，隔日一次，联合利巴韦林700mg/d 抗病毒治疗，治疗3月时即取得早期病毒学应答，治疗48周后停药，停药三个月后消失复发，再次使用派罗欣135g/w联合利巴韦林700mg/d 抗病毒治疗，2023-11-11开头，治疗四周时即取得快速病毒学应答，治疗48周，期间HCV RNA始终低于最低检测线，疗程完毕后停药见表1，HCV 5-NCR基因变异株，无Mbo酶切位点。,表1 为HCV 1b型患者治疗前后ALT与HCV RNA检测结果,病例2 女 45岁，2023-1-2开头使用一般干扰素-300MU，隔日一次，联合利巴韦林900mg/d 抗病毒治疗，治疗3月时即取得早期病毒学应答，治疗24周后消失病毒反弹，2023-8-18开头，改用派罗欣180g/w联合利巴韦林900mg/d 抗病毒治疗，治疗四周时即取得快速病毒学应答，治疗48周，期间HCV RNA始终低于最低检测线，疗程完毕后停药见表2。,表2为HCV 2a型患者治疗前后ALT与HCV RNA 检测结果,病例3，女，50岁，开头使用一般干扰素-300MU，隔日一次，联合利巴韦林900mg/d 抗病毒治疗，治疗3月时即取得早期病毒学应答，治疗24周后消失病毒反弹，后改用派罗欣135g/w联合利巴韦林900mg/d 抗病毒治疗，治疗四周时即取得快速病毒学应答，治疗36周时由于消失类风湿性关节炎停顿治疗，期间HCV RNA始终低于最低检测线，治疗完毕后3个月复查HCV RNA仍低于最低检测线见表3。,表3 为HCV2a 型患者治疗前后ALT与HCV RNA检测结果,病例4，女，41岁，2023-12-23开头使用一般干扰素-300MU，隔日一次，联合利巴韦林1000mg/d 抗病毒治疗，治疗6月时尚未取得病毒学应答，遂停药，于2023-7-4开头改用派罗欣135g/w联合利巴韦林1000mg/d 抗病毒治疗，治疗四周时即取得快速病毒学应答，治疗48周，期间HCV RNA始终低于最低检测线，疗程完毕后停药见表4，HCV 5NCR无Mbo I切点。,表4为HCV 1b型患者治疗前后ALT与HCV RNA检测结果,病例5，女，50岁，2023-9-2开头以一般干扰素-300MU，隔日一次，联合利巴韦林600 mg/d 抗病毒治疗，至2023-2-16消失病毒反弹，于2023-2-20开头，改用派罗欣135g/w联合利巴韦林600mg/d 抗病毒治疗，治疗四周时即取得快速病毒学应答，治疗48周，期间HCV RNA始终低于最低检测线，疗程完毕后停药见表5，HCV 5NCR无Mbo I切点。,表5 为HCV 1b型患者治疗前后ALT与HCV RNA检测结果,病例6，女，48岁，2023-11-18开头使用一般干扰素-300MU，隔日一次，联合利巴韦林900mg/d 抗病毒治疗，治疗1月时即取得早期病毒学应答，治疗24周后消失病毒反弹，2023-4-10开头，改用派罗欣135g/w联合利巴韦林900mg/d 抗病毒治疗，治疗六周时未取得快速病毒学应答，遂改用派罗欣180g/w联合利巴韦林900mg/d，治疗第四周时取得快速病毒学应答，现已经治疗38周，期间HCV RNA始终低于最低检测线，仍在治疗中见表6，HCV 5NCR以有Mbo I切点为主，有少量无Mbo I切点cDNA。,表6为HCV 1b型患者治疗前后ALT与HCV RNA检测结果,病例7，男，75岁，2023-6-1至2023-9-4 使用一般干扰素-100 MU，隔日一次，2023-7-1改用一般干扰素-300 MU，隔日一次，抗病毒治疗期间HCV RNA始终波动于104左右，2023-6-28停药见表7。,表7为HCV 2 a/1b型患者治疗前后ALT与HCV RNA检测结果,病例8，男，43岁，于2023-11-8开头连续使用一般干扰素-100 MU，隔日一次，抗病毒治疗期间HCV RNA始终波动于104左右，2023-06停药见表8，HCV 5NCR无Mbo I切点。,表8为HCV 1b型患者治疗前后ALT与HCV RNA检测结果,病例9，男，46岁，2023-4-13至2023-2-16，一般干扰素-300 MU，隔日一次，2023-2-18开头，派罗欣180g/w，治疗一疗程，治疗期间消失2型糖尿病以及甲状腺功能亢进，遂停药，于2023-6-8开头，派罗欣270g/w，共16针，治疗期间HCV RNA曾低于最低检出限，但反复消失波动，治疗效果差，现已停药见表9，HCV 5NCR无Mbo I切点。,表9为HCV 1b型患者治疗前后ALT与HCV RNA检测结果,表9为HCV 1b型患者治疗前后ALT与HCV RNA检测结果,讨 论,已有报道，HCV lb型5NCR变异状态，争论显示，在147例1b型丙型肝炎患者中，存在五种表现；仅有Mbo I切点株80例(54.42%)，无Mbo 切点株26例(17.69%)，存在两个Mbo 切点株6例(4.08%)，无Mbo 切点和有Mbo 切点同时存在株18例(12.24%)，有切点株17例(11.56%)。,早在2023年就有报道在HCV NS5区检测HCV RNA和酶切分型时，觉察在同基因型1b型内存在基因变异，无病症的HCV RNA阳性患者与血清ALT上升的HCV RNA阳性患者有明显区分。前者在8580位未检测出基因变异，而后