核酸凝胶电泳(精品)

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,核酸凝胶电泳,引言：,核酸是带均匀负电荷的生物大分子，在电场中向正极移动，不同大小和构象的核酸分子的电荷密度大致相同，在自由泳动时，各核酸分子的迁移率区别很小，难以分开。以适当浓度的凝胶介质作为电泳支持介质，具有分子筛效应，使得分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异，达到分离的目的。此为分离、鉴定、纯化核酸片段的标准方法。用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭（,EB,）进行染色，可直接在紫外灯下确定,DNA,在凝胶中的位置。,影响核酸电泳的因素：,1,核酸的性质,2,凝胶孔径的大小,3,电场强度和电场方向,4,电泳环境 缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移率。,核酸电泳的指示剂：,核酸电泳常用的指示剂有两种：,溴酚蓝,二甲苯青，,DNA,的琼脂糖凝胶电泳,引言：琼脂糖主要从海洋植物琼脂中提取来的，为一种聚合线性分子，一般含有多糖、蛋白质和盐等杂质，杂质的含量每个厂商和批号的产品不尽相同。对,DNA,电泳迁移率的影响也不一样，经化学修饰后熔点降低的琼脂糖叫低熔点琼脂糖，其机械强度无明显变化，主要用于,DNA,的限制酶原位消化、,DNA,片段回收以及小,DNA,片段（,10,500,bP,）的分离。琼脂糖凝胶的孔径取决于琼脂糖的浓度。,【,实验目的,】,掌握,DNA,琼脂糖凝胶电泳的原理和操作方法。,【,实验原理,】,DNA,分子带负电荷，在电场中受到电荷效应、分子筛效应向正极移动过程中，因,DNA,分子的大小及构象差别而呈现迁移位置上的差异，对于线形,DNA,分子，其电场中的迁移率与其相对分子质量的对数值成反比，电泳时加溴化乙锭，其与,DNA,结合形成一种荧光络合物，在,254,365 nm,紫外光照射下可产生桔红色的荧光，可用于检测,DNA,（此法可观察到凝胶中,2,ng,的,DNA,）。如有必要可从凝胶回收,DNA,片段，用于分子克隆或探针标记等操作。琼脂糖可制成不同孔径的凝胶，分离,DNA,的范围广，约,200,bp,50 kb,。,【,实验材料,】,1,电泳仪。,2,电泳槽。,3,紫外透射仪。,4,试剂,【,实验方法,】,1,琼脂糖凝胶板的制备 将,1,2%,琼脂糖凝胶加热溶化均匀，冷却到,60,70,加,EB,至浓度,0.5,g,/ml,，倒入封好的凝胶槽，厚度约,3,5 mm,，在距底板,0.5,1 mm,的位置放置样品梳，检查梳子齿间有无气泡，可用吸管小心吸出气泡，待冷却成形后取出梳子及隔板，放入水平电泳槽中，缓冲液淹没过胶,1,2 mm,为止。,2,加样 样品中加,1/5,体积的上样缓冲液，混匀，取,10,15,l,加入凝胶点样孔中，同时要设立合适的,DNA,相对分子质量标准物。,3,电泳 电压,10 V/cm,，电泳至溴酚蓝移出样品槽到凝胶板的,2/3,距离时，关闭电源。,4,取出凝胶块，置紫外透射反射分析仪上观察，即可见桔红色,DNA,区带。,【,实验思考,】,1,影响,DNA,片段琼脂糖电泳有哪几个因素？操作,DNA,琼脂糖凝胶电泳时为何要戴手套？,2,DNA,片段琼脂糖电泳操作应注意哪些问题？,