化学生物学导论-第三章核酸4-5节课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第三章,核酸,Nucleic Acid,王骊丽,第三章核酸Nucleic Acid王骊丽,1,DNA,碱基顺序的测定,RNA,碱基顺序的测定,第四节,核酸碱基序列顺序分析,(Sequence analysis of nucleic acids),DNA碱基顺序的测定第四节 核酸碱基序列顺序分析(Se,2,DNA,碱基顺序测定的基本步骤,DNA,片断的制备,DNA,碱基顺序测定,DNA 碱基顺序测定的基本步骤DNA 片断的制备,3,DNA,片断的制备,由于,DNA,的分子量很大，需要先将,DNA,分子切割或能够用于测定的小片段，共包括部分：,DNA,分子酶解：,将相对分子量质量大的片断用限制性内切酶技术完成，使切割成能够用于测定的小片段（,300-500bp),；,PCR,技术扩增,DNA,片段：,DNA,片段数量少的情况下，以获取一定数量用于序列测定。,返回,DNA 片断的制备由于DNA的分子量很大，需要先将DNA分子,4,杂交测序法,质谱法,单分子测序法,原子探针显微镜测序法,DNA,芯片法,化学降解法,(Maxam-Gillbert,法,1977,),双脱氧链终止法,(sanger,法,1977,),新技术方法,核酸序列分析,Nucleic Acid Sequence Analysis,经典方法,杂交测序法化学降解法(Maxam-Gillbert法,1,5,一、以化学裂解反应为基础,化学降解法,基本原理：,基于有机化学方法，选择性地切断核苷酸（,A,、,G,、,C,或,T,）所形成的磷酸二酯键，得到不同链长的,DNA,小片段；将这些片段经电泳分离；分析前，用同位素标记,DNA,的,5,末端，经放射自显影即可在,X,胶片上读出,DNA,链的序列。,主要两个步骤：碱基选择性水解；对水解产物,DNA,小片段进行电泳分析和碱基顺序的推断。,一、以化学裂解反应为基础化学降解法基本原理：基于有机化学方,6,硫酸二甲酯（,DMS,）：,使,DNA,分子中,嘌呤碱基选择性水解,，分别得到两种嘌呤碱基的甲基化产物：,N,3,-,甲基腺嘌呤核苷和,N,7,-,甲基鸟嘌呤核苷；,肼：,使,DNA,分子中,嘧啶碱选择性水解,，胸腺嘧啶（,T,）和胞嘧啶（,C,）的嘧啶环断裂，生成核糖腙衍生物；再在哌啶存在下水解，核糖腙,3-,位的磷酸酯键则被水解断裂；但高盐条件下，只,C,断裂，而不与,T,反应。,哌啶：,从修饰甲基处断裂核苷酸链。,在不同的酸、碱、高盐和低盐条件下，三种化学试剂按不同组合可以特异地切割核苷酸序列中特定的碱基。,特异性碱基化学切割反应,(1),硫酸二甲酯（DMS）：使DNA分子中嘌呤碱基选择性水解，分,7,G,反应：,DMS,使,G,在中性和高温条件下脱落。,G+A,反应：酸性条件（如甲酸）可使,A,和,G,嘌呤环上的,N,原子质子化，利用哌啶使,A,、,G,脱落。,T+C,反应：肼（低盐）,C,反应：肼（高盐）,测定,DNA,长度,250bp,。,特异性碱基化学切割反应,(2),G反应：DMS使G在中性和高温条件下脱落。特异性碱基化学切割,8,化学裂解法测定,DNA,的核苷酸序列,返回,化学裂解法测定DNA的核苷酸序列返回,9,二、以使用,DNA,聚合酶为基础,-DNA,链末端终止法,基本原理：,以,DNA,的酶促合成为基础，以被测,DNA,单链为模板，通过特殊设计的“末端终止技术合成出一系列相差一个核苷酸长度的互补链，然后利用凝胶电泳分离这些不同长度的,DNA,小片段，以此推测确定待测,DNA,链的碱基顺序。,主要步骤包括：末端终止法合成不同长度,DNA,小片段；,DNA,小片段电泳图谱解析。,二、以使用DNA聚合酶为基础-DNA链末端终止法,10,1977,年,sanger,发明末端终止法,“加减法”,Sanger,双脱氧终止法,DNA,酶法测序,DNA,自动测序仪,Sanger,法发展过程,1977年sanger发明末端终止法Sanger法发展过程,11,1,、“加减法”测定,DNA,序列的原理,以待定片断的单链,DNA,为模板,，首先加上一个适当的,引物,（一般用限制性内切酶解片段），再加入,4,种脱氧三磷酸,（,dNTP),为底物，其中一种用,放射性同位素,32,P,标记,（例如,32,PdATP),再加入,DNA,聚合酶,IKlenow,片断；,从引物,3,端合成出一条与模板互补的、具有放射性标记的,dDNA,链混合物，反应尽量不同步，使合成的产物中各种长度的片断都存在，然后经过琼脂糖柱纯化，除去反应混合物中多余的,4,种,dNTP,将纯化后的混合物分成两份，分别进行加减法反应系统。,1、“加减法”测定DNA序列的原理 以待定片断的单链DN,12,*,少一个,OH,脱氧核苷酸与双脱氧核苷酸结构,*少一个OH脱氧核苷酸与双脱氧核苷酸结构,13,2,、双脱氧链终止法,基本原理：,直接引入,双脱氧核苷三磷酸,作为链终止剂；,将待定,DNA,片断分为,4,组，在反应体系中仍然以,DNA,单链,为模板，需要,引物、,DNA,聚合酶,和,4,种,dNTP,(,其中一种用,32,P/,35,S,标记,),、一定比例不同种类的终止剂,2,，,3-,双脱氧三磷酸,(ddNTP,，特异性末端终止剂,),；,在,DNA,合成反应混合物的,4,种,dNTP,加入少量的一种,ddNTP,后，链的延伸将与偶而发生但却非常特异的链终止竞争，反应产物是一系列的核苷酸链，其长度取决于从用以起始,DNA,合成的引物末端到出现过早链终止的位置之间的距离。分别得到,ddA ddT ddG ddC,结尾的片段。,返回,2、双脱氧链终止法基本原理：返回,14,化学生物学导论-第三章核酸4-5节课件,15,3,、,DNA,酶法测序,平行进行四组反应，每组反应均使用相同的模板，相同,的引物以及四种脱氧核苷酸；,在四组反应中各加入适量的四种之一的双脱氧核苷酸，,使其随机地接入,DNA,链中，使链合成终止，产生相应的,四组具有特定长度的、不同长短的,DNA,链。,四组,DNA,链再经过聚丙烯酸胺凝胶电泳按链的长短分离,开，经过放射自显影显示区带，就可以直接读出被测,DNA,的核苷酸序列,如下图所示：,3、DNA酶法测序 平行进行四组反应，每组反应均使用相同的,16,DNA,酶法测序,DNA酶法测序,17,三、,DNA,自动测序,采用,荧光,替代,放射性核素标记,是实现,DNA,序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行,Sanger,测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小,DNA,片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定,DNA,碱基的排列顺序。,三、DNA自动测序采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列,18,化学生物学导论-第三章核酸4-5节课件,19,第一步 加入复制终止剂,荧光检测探头,电泳，看谁跑得快,第一步 加入复制终止剂荧光检测探头电泳，看谁跑得快,20,ddNTPs,参与下的,DNA,复制,Sanger,法测序产物的平均链长取决于,ddNTP,：,dNTP,的比例，比例高时，得到较短的产物；,“标记终止法”测序产物的平均长度可通过标记反应中,dNTP,浓度,(,高浓度能得到长的产物,),或终止反应的,ddNTP:dNTP,来调整。,ddNTPs参与下的DNA复制 Sanger法测序产,21,第二步 荧光检测,DNA,带负电,DNA,在电泳胶中的迁移率与其片段大小有关,第二步 荧光检测DNA 带负电,22,DNA,自动测序结果,DNA自动测序结果,23,化学生物学导论-第三章核酸4-5节课件,24,RNA,碱基顺序测定方法,RNA,链碱基顺序的测定比较复杂；,逆转录法，以待测的,RNA,链为模板，在逆转录酶纯化下，合成,DNA(,与,RNA,互补的,DNA,分子，常用,cDNA,表示,),；,用,化学降解法,或双脱氧链终止法,测定,DNA,碱基顺序，再得出,RNA,的碱基顺序。,RNA 碱基顺序测定方法RNA 链碱基顺序的测定比较复杂；,25,应用一套已知序列的寡核苷酸探针去寻找靶,DNA,链上的互补序列，靶,DNA,上的序列根据杂交情况来确定。,杂交测序,应用一套已知序列的寡核苷酸探针去寻找靶DNA链上的互补序列，,26,一、化学正在向生命科学领域渗透,。,二、,DNA,测序的研究工作,历经了数十年,成绩辉煌,曾两次获得诺贝尔奖。而后基因组的研究工作是更有意义且更具挑战性的，它必将激发科学家更大的创造力！,分析化学的新发展,一、化学正在向生命科学领域渗透。,27,正在发展的几种测序方法,1,）毛细管电泳激光荧光法,2,）超薄层板电泳激光荧光法,3,）八聚体测序技术,4,）转录测序,5,）质谱法,6,）原子探针显微镜,7,）流动式单分子荧光检测法,8,）芯片测序,正在发展的几种测序方法,28,核酸分子的核苷酸序列分析是以纯品核酸为材料，经水解，测定核苷酸组成及比例；,先以,外切酶,确定,5-,或,3-,末端核苷酸，再以,内切酶,将核酸链分为若干寡核苷酸段，分段测定核苷酸组成、比例和序列；,最后将核苷酸序列的各寡核苷酸重叠，确定整个核酸分子的核苷酸序列。,核酸碱基顺序测定,核酸分子的核苷酸序列分析是以纯品核酸为材料，经水解，测定核苷,29,酶,底物,作用部位,作用产物,外切酶,磷酸二酯酶,DNA,，,RNA,5,端，,5,连接处,3,核苷酸,3,端，,3,连接处,5,核苷酸,内切酶,脱氧核糖,核酸酶,I,DNA,3,连接处,3,-,羟核苷酸为,3,末端寡核苷酸及剩余部分,脱氧核糖,核酸酶,II,5,连接处,3,-,核苷酸为,3,末端寡核苷酸及剩余部分,核糖核酸,酶,T,1,RNA,5,连接处碱基是,G,3,-,鸟苷酸为,3,末端寡核苷酸及剩余部分,核糖核酸,酶,I,5,连接处碱基是,Pyr,3,-,嘧啶类核苷酸为,3,末端寡核苷酸及剩余部分,核苷酸序列分析中断裂磷酸二酯键用酶,返回,酶底物作用部位作用产物外切酶磷酸二酯酶 DNA，5端，5,30,第五节,核酸的催化性质,The catalytic properties of nucleic acids,第五节 核酸的催化性质The catalytic pro,31,核酶（,Ribozyme,）,核酶的发现,核酶的催化性质,核酶的研究中的两个问题,核酶（Ribozyme）核酶的发现,32,核酶的发现,Altman,发现,RNase-P,的蛋白部分不具催化功能，而,RNA,部分在有足够浓度,Mg,2+,离子存在下，能起核酸水解酶的作用。,Cech,发现,RNA,原生动物四膜虫的,Pre-rRNA,是一种具有自催化性能的核酶。,证明了核酸既是信息分子，又是功能分子,核酶的发现Altman发现RNase-P的蛋白部分不具催化功,33,核 酶,催化性,DNA(DNAzyme),人工合成的寡聚脱氧核苷酸片段，也能序列特异性降解,RNA,。,催化性,RNA(ribozyme),序列特异性的核酸内切酶,参与,RNA,转录后加工修饰,作为针对病毒或肿瘤基因的药物降解,mRNA,。,核 酶催化性DNA(DNAzyme)人工合,34,核酶的催化性质,RNA,作用于,RNA,核酸酶催化的反应主要包括,:,水解反应,(RNA,限制性内切酶活性,),，连接反应,(,聚合酶活性,),和转核苷酰反应等。,最近核酸酶的其他作用底物也已被发现，如多糖、,DNA,以及氨基酸酯等。,核酶的催化性质RNA作用于RNA,35,核酶的催化过程图,转酯作用,转酯作用,核酶的催化过程图转酯作用转酯作用,36,核酸酶,是指所有可以水解核酸的酶,依据底物不同分类,DNA,酶,(deoxyribonuclease,DNase),RNA,酶,(ribonuclease,RNase),依据切割部位不同分类,核酸内切酶：,限制性核酸内切酶,非特异性核酸内切酶,核酸