分子医学技能：酶联免疫斑点(ELISPOT)技术课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,酶联免疫斑点,(ELISPOT),技术,酶联免疫斑点(ELISPOT)技术,ELISPOT,（,Enzyme-linked Immunospot Assay,）,结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术（即,ELISA,技术），能够在,单细胞水平,检测细胞因子的分泌情况；,用抗体,原位,捕获培养中的细胞分泌的细胞因子，并以酶联,斑点显色,的方式将其表现出来。,ELISPOT（Enzyme-linked Immunosp,特点：,斑点可持久保存并进行计数分析,易操作、有效、快速、灵敏度高,细胞因子的检测不易受非分泌细胞的干扰,比传统的,ELISA,和细胞内细胞因子染色法敏感20-200倍,样本量大的情况下实验结果可用计算机图象分析系统进行快速、客观的分析,特点：,Coating Ab,包被培养孔,根据实验设计加入淋巴细胞及含或不含刺激因子的培养液孵育,基 本 原 理,Coating Ab 包被培养孔根据实验设计加入淋巴细胞及含,活化的淋巴细胞可分泌细胞因子与,Coating Ab,结合,洗除细胞，依次加入生物素标记的抗细胞因子抗体及酶标抗生物素抗体进行反应,加入酶底物显色形成斑点（,SPOT）,活化的淋巴细胞可分泌细胞因子与Coating Ab结合洗除细,Coating Ab,包被培养板,每孔加入,200ul,培养基,封闭,按实验设计,加入含或不含刺激剂的培养液,及一定数目细胞孵育,20-24,小时,4,0,C,过夜,室温孵育1小时,无菌,直接取外周血,单核细胞或,脾淋巴细胞,基 本 操 作,Coating Ab每孔加入200ul培养基按实验设计40C,去除细胞,加入生物素标记,的,detector Ab,加入酶标抗生物素抗体(,GABA),加入显色剂,I,/,II,暗处室温孵育20-30分钟,PBST,洗板,室温孵育,2,小时后，,PBST,洗板,室温孵育1小时后，洗板,去离子水清洗培养板,室温干燥后,在倒置显微镜下观察结果,非无菌,去除细胞加入生物素标记加入酶标抗生物素抗体(GABA)加入显,技 术 要 点,预孵育的淋巴细胞若有坏死/凋亡（培养液过黄）会影响斑点的形成,提取淋巴细胞时应尽量去除红细胞的干扰,加入,ELISPOT,培养孔的细胞须为单细胞悬液,细胞孵育过程应保证,ELISPOT,培养板静置，,CO,2,培养箱应保证稳定，避免震荡,稀释抗体及,GABA,冻干粉时建议无菌操作，保存过程避免细菌的污染以保证其效用,显色剂,I,和,II,应避光保存，不使用时切勿混合,技 术 要 点 预孵育的淋巴细胞若有坏死/凋亡（培养液过黄,ELISPOT,实 验 结 果 示 意 图,ELISPOT 实 验 结 果 示 意 图,分子医学技能：酶联免疫斑点(ELISPOT)技术课件,双色,ELISPOT,原理,双抗体包被,培养细胞,细胞因子,A,细胞因子,B,包被抗体,HRP-,检测抗体,Biotin-,检测抗体,碱性磷酸酶,-,streptavidin,BCIP/NBT,底物,AEC,底物,斑点形成,细胞因子,A,细胞因子,B,双色ELISPOT原理双抗体包被培养细胞细胞因子A细胞因子B,双色,ELISPOT,结果示意图,蓝色：,IFN-,红色：,IL-2;,蓝色：,IFN-,红色：,IL-17,双色ELISPOT结果示意图 蓝色：IFN-,红色：IL-,B,细胞杂交瘤的筛选,化合物和药物免疫学反应的检测,优化树突细胞和,T,细胞的抗肿瘤活性,靶向疫苗的质控,自身免疫疾病的诊断和预后分析,自身免疫疾病免疫治疗的监控,过敏性疾病的脱敏治疗的监测,器官移植中排斥反应的预测,微量组织、肿瘤和免疫细胞分泌谱的分析,结核病的诊断,ELISPOT,方法主要用途,B细胞杂交瘤的筛选 ELISPOT方法主要用途,Thank you!,Thank you!,