RNA病毒检测简述ppt课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第一章,RNA,的提取和,cDNA,的合成,第一章 RNA的提取和cDNA的合成,RT-PCR,原理,提取总,RNA,以其中的,mRNA,作为模板,反转录,cDNA,PCR,作模板,获得目的基因,RT-PCR原理提取总RNA以其中的mRNA作为模板 反转录,一、,RNA,的提取,RNA,易降解，在提取过程中要严格防止,RNA,酶的污染，并设法抑制其活性。,RNA,酶稳定，并广泛存在，如各种组织、人的皮肤、手指、试剂、容器等。,一、RNA的提取RNA易降解，在提取过程中要严格防止RNA酶,采取的措施：,1,、,全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。,2,、所用的玻璃器皿需置于干热灭菌箱中,200,烘烤,2h,以上。,3,、不能用高温烘烤的材料，如塑料容器、试剂等可用,0.1%,的焦碳酸二乙酯,(DEPC),水溶液处理，然后高压灭菌以消除残存的,DEPC,。,采取的措施：,注意事项：,1,、,DEPC,与氨水溶液混合会产生致癌物。,2,、,DEPC,能与氨基和巯基反应，因而含,Tris,和,DTT,（二硫苏糖醇）的试剂不能用,DEPC,处理。,3,、,Tris,溶液可用,DEPC,处理的水配制然后高压灭菌。,4,、配制的溶液如不能高压灭菌，可用,DEPC,处理水配制，并尽可能用未曾开封的试剂。,注意事项：,总,RNA,提取方法（试剂盒）：,异硫氰酸胍苯酚法（,Trizol,法）,原理：,（,1,）,Trizol,的,主要成分是酚,。主要作用是,裂解细胞,，使细胞中的蛋白、核酸物质解聚得到释放。酚是有效的,蛋白变性剂,，但不能完全抑制,RNA,酶活性，因此,Trizol,中还加入了,8-,羟基喹啉、异硫氰酸胍、,-,巯基乙醇等来抑制内源和外源,RNase,。,异硫氰酸胍,属于解偶剂，是一类,强力的蛋白质变性剂,，可溶解蛋白质，并使蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，,核蛋白迅速与核酸分离,。,总RNA提取方法（试剂盒）：,（,2,）,氯仿,可使,蛋白变性,，降低蛋白的溶解度。其主要作用是,分相,，实际上是,加速有机相和水相的分层,。,上层水相，,pH 5.1,左右，当溶液,pH,在酸性的时候，,DNA,分子就会沉淀在酚与溶液的界面，只有,RNA,分子留在水相。,而当,pH,接近中性时，,DNA,就会溶解在水相，（导致,pH,中性的原因可能是,trizol,与样品比例不对，应该尽量保证提取量的前提下使,trizol,过量）。同时，氯仿可以去除核酸溶液中的痕量的酚。,（2）氯仿可使蛋白变性，降低蛋白的溶解度。其主要作用是分相，,（,3,）,异丙醇作用,是,沉淀,RNA,。异丙醇沉淀，优点是容积小且速度快，主要沉淀,DNA,和大分子,rRNA,和,mRNA,，对,5sRNA,、,tRNA,不产生沉淀，所以,RNA,电泳的标志性三条带中,5sRNA,带很不清楚，未必是你的,RNA,降解。但是异丙醇难以挥发出去。,（,4,）因为上述试剂会影响后续实验，所以用,75%,乙醇洗,1-2,次,。一是乙醇可以溶解一些沉淀中可能的有机物杂质；二是洗掉异丙醇、氯仿，乙醇易挥发，痕量的乙醇很容易挥发掉。,（3）异丙醇作用是沉淀RNA。异丙醇沉淀，优点是容积小且速度,Yeast Total RNA,Yeast Total RNA,二、,cDNA,的合成,反转录酶：依赖于,RNA,的,DNA,聚合酶,种类：两种,1,、禽类成髓细胞病毒（,AMV,）反转录酶,包括两个多肽亚基（,最适温度,42,）,活性：依赖于,RNA,的,DNA,合成，依赖于,DNA,的,DNA,合成以及对,DNA:RNA,杂交体的,RNA,部分进行内切降解,(RNA,酶,H,活性,),。,二、cDNA的合成反转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶,2,、鼠白血病病毒,(M-MLV),反转录酶,只有单个多肽亚基（,最适温度,37,）,活性：依赖于,RNA,和依赖于,DNA,的,DNA,合成活性，但降解,RNA:DNA,杂交体中的,RNA,的能力较弱，且对热的稳定性较,AMV,反转录酶差。,M-MLV,反转录酶能合成较长的,cDNA(,如大于,2-3kb),。,2、鼠白血病病毒(M-MLV)反转录酶,cDNA,引物,种类：,1,、随机引物,：不特异的引物,体系中所有,RNA,分子全部充当了,cDNA,第一链模板，,PCR,引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的,cDNA,中,96%,来源于,rRNA,。,cDNA引物,2,、,Oligo(dT),：,是一种对,mRNA,特异的引物,绝大多数真核细胞,mRNA,具有,3-,端,Poly(A),尾，此引物（,12-18,核苷酸）与其配对，仅,mRNA,可被反转录。,由于,Poly(A)RNA,仅占总,RNA,的,1-4%,，故此种引物合成的,cDNA,比随机引物得到的,cDNA,在数量和复杂性方面均要小。,2、Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的引物,3,、特异性引物,用含目标,RNA,的互补序列的寡核苷酸作为引物，用此类引物仅产生所需要的,cDNA,，导致更为特异的,PCR,扩增。,3、特异性引物,第二章 聚合酶链式反应（,PCR,）,*,PCR,，即聚合酶链式反应（,Polymerase chain reaction,）,是一种对特定的,DNA,片段在体外进行快速扩增的方法。,*,由,1985,年穆里斯（,K.Mullis,）发明，他也因此获得了,1993,年的诺贝尔化学奖。,第二章 聚合酶链式反应（PCR）*PCR，即聚合酶链,PCR,的原理：,体外,DNA,复制,包括高温变性、低温退火和中温延伸过程。,PCR的原理：体外DNA复制,一、,PCR,基本步骤,三个步骤：,1,、,变性,(Denature),：双链,DNA,目的片段在,94,下解链。,2,、,退火,(Anneal),：两种寡核苷酸引物在适当温度,(50,左右,),下与模板上的目的序列通过氢键配对。,3,、,延伸,(Extension),：在,Taq DNA,聚合酶合成,DNA,的最适温度,(72,左右,),下，以目的,DNA,为模板进行合成。,一、PCR基本步骤三个步骤：,二、,PCR,反应中的主要成分,引物,：好坏是,PCR,成败的关键。,设计原则,：,1,、引物长度约为,16-30bp,。,2,、引物中,G+C,含量通常为,40%-60%,，粗略估计引物的解链温度,Tm,4(G+C)+2(A+T),，且接近,72,最好。,3,、四种碱基应随机分布，在,3,端不存在连续,3,个,G,或,C,，因这样会使引物在,G+C,富集序列区引发错误。,二、PCR反应中的主要成分引物：好坏是PCR成败的关键。,4,、引物,3-,端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应，以减少由于密码子摆动产生的不配对。,5,、在引物内，尤其在,3-,端应不存在二级结构，且,3-,端尽量不用,A,，尤应避免连续,2,个或,2,个以上,A,，因为,A,引发错配的几率高；最好选择,T,。,4、引物3-端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核,6,、两引物之间尤其在,3-,端不能互补，以防出现引物二聚体，减少产量。两引物间最好不存在,4,个连续碱基的同源性或互补性。,7,、引物,5-,端对扩增特异性影响不大，可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点等，通常应在,5-,端限制酶位点外再加,1-2,个保护碱基。,6、两引物之间尤其在3-端不能互补，以防出现引物二聚体，减,8,、引物不与模板结合位点以外的序列互补。,引物浓度,：,一般,PCR,反应中的引物终浓度为,0.2-1.0mol/L,。,引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体，过低则降低产量。,8、引物不与模板结合位点以外的序列互补。,4,种三磷酸脱氧核苷酸,(dNTP),：,dNTP,原液一般配成,2.5-10mmol/L,分装，,-20,贮存。,一般反应中每种,dNTP,的终浓度为,20-200mol/L,。,当,dNTP,终浓度大于,50mmol/L,时可抑制,Taq DNA,聚合酶的活性。,4,种,dNTP,的浓度应该相等，以减少合成中由于某种,dNTP,的不足出现的错误掺入。,4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)：,Mg,2+,：,Mg,2+,浓度对,Taq DNA,聚合酶影响很大，它可影响酶的活性和真实性，影响引物退火和解链温度，影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。,通常,Mg,2+,浓度范围为,0.5-2mmol/L,。对于一种新的,PCR,反应，可以用,0.1-5mmol/L,的递增浓度的,Mg,2+,进行预备实验，选出最适的,Mg,2+,浓度。,Mg2+：,在,PCR,反应混合物中，应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团，例如磷酸基团或,EDTA,等可能影响,Mg,2+,浓度的物质，以保证最适,Mg,2+,浓度。,模板,：,PCR,中模板,DNA,可以是单链分子，也可以是双链分子，可以是线状分子，也可以是环状分子,(,线状分子比环状分子的扩增效果稍好,),。,在PCR反应混合物中，应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团，例,就模板,DNA,而言，影响,PCR,的主要因素是模板的数量和纯度。,一般反应中模板量为,10,2,-10,5,个拷贝。扩增单拷贝基因，需要,0.1g,的人基因组,DNA,，,10ng,的酵母,DNA,，,1ng,的大肠杆菌,DNA,。多拷贝基因扩增用量更少。,模板过多可能增加非特异性产物。,DNA,中的杂质也会影响,PCR,的效率。,就模板DNA而言，影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度。,Taq DNA,聚合酶,：,一般,Taq DNA,聚合酶活性半衰期为,92.5 130min,，,95 40min,，,97 5min,。,Taq DNA,聚合酶的酶活性单位定义为,74 30min,，掺入,10nmol/L dNTP,到核酸中所需的酶量。,Taq DNA,聚合酶的一个致命弱点是它的出错率，一般,PCR,中出错率为,210,-4,核苷酸,/,每轮循环，在利用,PCR,克隆和进行序列分析时尤应注意。,Taq DNA聚合酶：,所用的酶量可根据,DNA,、引物及其它因素的变化进行适当的增减。酶量过多会使产物非特异性增加，过少则使产量降低。,反应结束后，需要灭活,Taq DNA,聚合酶。,灭活,Taq DNA,聚合酶的方法有：,(1)PCR,产物经酚,/,氯仿抽提，乙醇沉淀。,(2),加入,10mmol/L,的,EDTA,螯合,Mg,2+,。,(3)99-100,加热,10min,。目前已有直接纯化,PCR,产物的,Kit,可用。,所用的酶量可根据DNA、引物及其它因素的变化进行适当的增减。,反应缓冲液,：,反应缓冲液一般含,10-50mmol/L TrisCl(20,下,pH8.3-8.8),，,50mmol/L KCl,和适当浓度的,Mg,2+,。,50mmol/L,的,KCl,有利于引物的退火。,加入,5mmol/L,的二硫苏糖醇,(DTT),或,100g/ml,的牛血清白蛋白,(BSA),，可稳定酶活性；加入,T4,噬菌体的基因,32,蛋白对扩增较长,DNA,片段有利。,各种,Taq DNA,聚合酶商品都有自己特定的缓冲液。,反应缓冲液：,