乙型病毒性肝炎的实验室检查

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,乙型病毒性肝炎的实验室检查,报告人：付红伟,天津医大总医院,检验中心,2011.1.21,我国,HBV,感染概况,一般人群,HBsAg,携带率高达,7.18%,；,现有慢性,HBV,感染者约,9 300,万人,，占全世界的,1/4,；,其中慢性乙型病毒性肝炎患者超过,2 000,万例，占全世界慢性乙肝患者的,1/3,；,15,岁以下儿童,HBsAg,携带率下降显著，,1-4,岁组仅为,0.96%,；,1 4,岁组,HBsAb,阳性率由,1992,年,15.75%,升至,72.25%;,抗,HBcAb,阳性率由,1992,年,30.08%,降至,3.76%,；,2,HBV,基因组,HBV DNA,是由,长链,L(,负链,),和,短链,S(,正链,),组成的不完全双链环状,DNA,，短链的长度相当于长链的,50%,85%,。,HBV DNA,长链载有病毒蛋白质的全部密码，有,4,个开放读码框架,(ORF),，分别称为,S,、,C,、,P,和,X,区。编码,7,个蛋白质。,HBV DNA,易发生变异，特别是前,S,或,S,区基因较易突变。,嗜肝,DNA,病毒的共同特点：,内含,33.3kb,松散环状、部分双链,DNA,基因组,及,DNA,聚合酶；病毒的复制需逆转录过程。,3,HBV,抗,原,和抗体系统,表面抗原,(HBsAg),：,HBV,外膜糖蛋白,=S+L+M,蛋白,S,蛋白：狭义的,HBsAg,指,S,蛋白。,HBsAg,阳性说明机体有,HBV,感染。,中分子蛋白：,preS2+S,大分子蛋白：,preS1+preS2+S,S,蛋白,中分子蛋白,大分子蛋白,PreS1,PreS2,S,1.HBsAg,和抗,-HBs,e,抗原,(HBeAg),：,是可溶性蛋白质,只存在于血液中,是病毒复制和传染性的标志,e,抗体,(,抗,-HBe),：,对,HBV,感染有一定的保护作用,其出现标志着病毒复制减少、传染性降低,前,C,区,C,区,前,C/C,蛋白,HBeAg,HBcAg,表达,切割、加工,HBeAg,只存在于血清中,HBV C,基因,分泌到细胞外,2.HBeAg,和抗,-HBe,5,HBV,的三种形态,1,Hepatitis B virion(Dane particle),2,secreted filament,3,secreted sphere,6,7,HBV,自然复制周期,8,生物化学检测,1,HBV,血清标志物的检测,2,HBV,分子生物学诊断,3,HBV,临床药物疗效检测,4,HBV,感染的实验室检查,1.,乙型肝炎的生物化学检测,主要指标,：,ALT,AST,ASTm,，,血清白蛋白，,血清胆红素，,胆碱酯酶,甲胎蛋白,凝血酶原时间,(PT),及部分凝血因子,；,9,方法学的发展,ELISA,：,灵敏性高，成本低，适用于普通病人筛查；,胶体金免疫层析法,(,金标法,),：,简便易行，可用于急诊病人快速检测；,化学发光法定量检测：,价格昂贵，可用于,HBVMs,为临界值的病人的确证；,可间接反映宿主,HBV,的复制水平，在评价抗病毒治疗的病毒学应答、疗效和判断预后方面有重要意义。,新增检测指标,PreS1,、,PreS2,及其相应抗体,对乙肝两对半的新认识,10,2.,HBV,血清标志物检测,11,HBV,血清标志物检测方法的成本效果分析,(1),12,HBV,血清标志物检测方法的成本效果分析,(2),Back,13,Terminal,protein,Spacer,Reverse,Transcriptase,(RT),RNaseH,rt1,rt344,preS1,preS2,S,s1,s266,HBsAg,X,Mutation of S&Pre-S,S,基因,“,a,”,决定簇,G 145 R,变异，与抗,-,HBs,的亲和力降低,S,基因变异可导致,隐匿性,HBV,感染,(occult HBV infection),，表现为血清,HBsAg,阴性，但仍可有,HBV,低水平复制,(,血清,HBV DNA,常,10,5,copies/ml,ALT 2 ULN;,HBeAg,阴性，,HBV DNA,载量,10,4,copies/ml,ALT 2 ULN;,HBV DNA,持续阳性，年龄,40,岁，,ALT,大于正常上限，也可给予抗病毒治疗；,HBV DNA,持续阳性，年龄,40,岁，,ALT,持续正常，应密切随访，动态观察疾病进展，必要时行肝组织检测，有病变证据时，可以给予抗病毒治疗；,23,HBV,感染抗病毒治疗的疗效评估,治疗终点：,HBV DNA,明显下降或低于检测下限，并伴有,ALT,正常；,HBV DNA,水平治疗开始后,3,个月内持续下降,1 log,以上才说明治疗有效；,每日,0.5mg,恩替卡韦治疗,1,年时,HBeAg,阳性和阴性慢性乙型肝炎患者,HBV DNA,检测不到率分别为,67%,和,90%,恩替卡韦的,HBeAg,转换率为,21%,与其他口服抗病毒药相似。,并不以,HBeAg,转阴或,HBsAg,转阴为治疗终点或目标。,24,HBV DNA,定量检测试剂盒的性能对比,25,26,同时可以实现对,HCV,HIV-1,衣原体，及淋病的一体化检测,Back,病毒基因突变,疾病进展,临床表现,对干扰素应答,耐药变异,生化学改善,HBeAg,血清学转换,HBV DNA,清除,急性乙型肝炎,慢性乙型肝炎,肝硬化,(LC),肝细胞癌,(HCC),27,HBV,基因型,/,基因亚型,分型方法,优缺点,序列测定法,最直接，最可信，是,HBV,基因分型的金标准，但繁琐费时而且价格昂贵，混合型检测能力差，不适于大样本检测。,聚合酶链反应,-,限制性片段长度多态性分析法,(PCR-RFLP),较测序法简便，适于大样本检测，但由于需要进行酶切，所以操作仍较为繁琐，成本较高，并存在酶切不彻底等问题。,pre-S2,单克隆抗体酶联免疫测定,(mAbs EIA,法,),简单、快速，已商品化，适于大样本检测，但检测费用较高并不能有效鉴别有些混合型感染和,HBsAg,低表达及某些表位表达不充分的标本。,分子探针杂交法,简单、快速，对混合型检测非常敏感，已商品化，适于大样本检测，但检测费用较高而且灵敏度和特异度还有待提高。,型特异性引物,PCR,法,简单、快速，成本低，具有较高的灵敏度，适于流行病学研究和临床大样本检测。但特异度还有待提高。,常用,HBV,基因分型方法比较,28,B,型,特异性,“,引物对,”,的特异度分析,B,型,特异性引物,HB,（正义链）：,5-ACC GTG AAC GCC CAC MGG AA-3,29,Back,4.HBV,临床药物治疗监测,乙肝病毒的耐药性检测，是,精准治疗乙肝,的关键！,目前由于治疗不够规范，造成我国目前超过,95%,的乙肝患者发生耐药、病毒变异、病毒耐药，变异检测势在必行！,拉米夫定是第一个被批准治疗慢性乙型肝炎的口服抗病毒药,已在全世界广泛应用。但其耐药发生率高,治疗,1,年时耐药发生率为,23%,2,年为,46%,3,年为,55%,4,和,5,年分别为,65%,和,71%,。,30,耐药,-,核苷,(,酸,),类似物,(NA),治疗失败最重要原因,31,拉米夫定,LMV,阿德福韦酯,ADV,替比夫定,LdT,恩替卡韦,ETV,HBV,替诺福韦,TDV,NAs,：,抑制病毒复制,长期使用,耐药变异,临床耐药,表型耐药,基因耐药,耐药,研究,32,33,34,Polymerase,Terminal,protein,Spacer,Reverse,Transcriptase,(RT),RNaseH,rt1,rt344,逆转录酶,(RT),区某些位点变异与耐药相关,preS1,preS2,HBsAg,s1,s266,可同时分析：耐药变异，,HBsAg,变异，基因型，血清型,全长,RT,区分析技术路线,HBV DNA,提取,snPCR,扩增,RT,区,PCR,产物直接测序,生物信息学分析与数据信息挖掘,血清与资料收集,Neg.,B,C,kb,可同时分析：耐药变异，,HBsAg,变异，基因型，血清型,35,小 结,36,更新了对乙肝两对半结果的认识；,Pre-S1,的临床价值和应用；,HBV DNA,检测的临床价值和意义；,HBV,耐药株和耐药位点筛查方法的建立。,37,Thanks for your attention,报告人：付红伟,Email:,