葡萄糖氧化酶法测定血糖浓度

5/13/15,单击鼠标编辑标题文字格式单击此处编辑母版标题样式,单击鼠标编辑大纲文字格式,第二个大纲级,第三大纲级别,第四大纲级别,第五大纲级别,第六大纲级别,第七大纲级别,单击鼠标编辑标题文字格式单击此处编辑母版标题样式,单击鼠标编辑大纲文字格式,第二个大纲级,第三大纲级别,第四大纲级别,第五大纲级别,第六大纲级别,第七大纲级别单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,5/13/15,5/13/15,单击鼠标编辑标题文字格式单击此处编辑母版标题样式,单击鼠标编辑大纲文字格式,第二个大纲级,第三大纲级别,第四大纲级别,第五大纲级别,第六大纲级别,第七大纲级别单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,5/13/15,单击鼠标编辑标题文字格式,单击鼠标编辑大纲文字格式,第二个大纲级,第三大纲级别,第四大纲级别,第五大纲级别,第六大纲级别,第七大纲级别,单击鼠标编辑标题文字格式单击此处编辑母版标题样式,5/13/15,单击鼠标编辑大纲文字格式,第二个大纲级,第三大纲级别,第四大纲级别,第五大纲级别,第六大纲级别,第七大纲级别,生物化学与分子生物学专业,XXX,邮箱:,葡萄糖氧化酶法测定血糖浓度,1.掌握血糖测定原理，计算方法，参考正常值，临床意义。,2.了解尿糖的测定及意义,。,1.收集耳缘静脉血,制备血浆,葡萄糖氧化法比色测定血糖浓度。,2.收集尿液,班氏法测定。,一.实验要求,二.实验内容,血糖（blood glucose,BG）指血浆（清）中的糖类物质，主要为葡萄糖。,一.血糖的来源：,食物、糖原的分解、糖异生。,二.血糖的去路：,有氧氧化、转换成非糖物质、尿排出、糖酵解。,血糖,正常血糖浓度:3.9-6.1 mmol/L(成年人空腹),低血糖:低于 2.8 mmol/L,高血糖:超过 7.8 mmol/L,2.低血糖的因素：胰岛素、磺脲类药、饮酒、严重饥饿,高血糖的因素：进食、情绪紧张时、糖尿病.,3.糖尿病的诊断和治疗监视、新生儿低血糖症等.,肾上腺素由肾上腺髓质分泌的一种儿茶酚胺激素。,肾上腺素升高血糖机制：,在应激状态、内脏神经刺激和低血糖等情况下，肾上腺素被释放入血液循环，促进糖原分解并升高血糖，促进脂肪分解，促进非糖物质向血糖的转化，使血糖浓度增大。,肾上腺素,adrenaline;epinephrine,一、血糖测定,福林-酚试剂法,葡萄糖氧化酶法,邻甲苯胺法,葡萄糖氧化酶法原理,葡萄糖O,2,H,2,O,葡萄糖酸H,2,O,2,葡萄糖氧化酶（GOD）,氧化，37,o,C,H,2,O,2,苯酚 4-氨基安替吡啉,H,2,O 红色,醌亚胺,+,O,2,37,o,C 辣根过氧化物酶（POD）,Trinder反应,溶液在505nm下有吸收峰,可用比色法测定,得出葡萄糖的浓度。,标准浓度法,A,标,=,K,C,标,L,A,样,=,K,C,样,L,C,样,=,A,样,A,标,C,标,【试剂】酶酚混合试剂（PH7.0）,5mmol/L葡萄糖标准应用液,班氏试剂,【器材】试管、试管架、吸量管、移液枪、恒温水浴、722型分光光度计。,实验前准备,【标本】,1.血浆 应在血液采集1小时内尽早分离。,具体操作,（1）,称重；,（2）,取血：,找到耳缘静脉，二甲苯擦拭，涂薄层凡士林（有何作用）。,用三棱针刺破耳缘静脉放血(自然血流)，将血液收集于草酸钠抗凝管内（边接边摇,以防凝固），取约5ml。,离心，2000rpm，10min，取上清，编号；,（3）,注射激素后再取血:,皮下注射肾上腺素(0.4mg/kg体重)，记录在注射时间。,30min后取血5ml于抗凝管内,离心，2000rpm，10min，取上清，编号。,（4）取4支试管，按下表加入试剂:,标准(ml),正常(ml),注射后(ml),空白(ml),血清样品,葡萄糖标准液,蒸馏水,酶酚混合试剂,0.02,3.00,0.02,3.00,0.02,3.00,0.02,3.00,将各管充分混匀，37 水浴中保温15min；取出冷却至室温后，505nm处比色；以空白管调零，读取标准管及测定管光密度值。,计算：,测定管,葡萄糖含量,（mmol/L）,测定管光密度,标准管光密度,5,1.注射,前,后,的血糖浓度,2.注射后血糖浓度增高率,A,肾,-A,正,A,正,100%,增高率,=,结果记录,标准(ml),正常(ml),注射激素后(ml),空白(ml),A,血糖浓度,增高率,尿糖是指尿中的糖类，主要是指尿中的葡萄糖。正常情况下，肾小管能将肾小球滤过的葡萄糖全部重吸收回血液，当,血糖,肾糖阈,8.96-10.08mmol/L,超过肾小管的重吸收能力,部分葡萄糖随尿排出。尿糖的测定虽然不能单纯作为糖尿病的诊断标准，但是从某种层面上也能反映一些问题。,血浆,尿糖,尿糖,动脉血,血细胞、大分子蛋白质等,部分水、无机盐、,葡萄糖,、维生素、尿素等,重吸收,近端小管,二、,二、,1.,班氏定性试验：,2.葡萄糖氧化酶试纸法（干化学法）：反应原理同血糖葡萄糖氧化酶法。,尿糖测定,班氏定性试验原理：,利用葡萄糖或其它还原性物质在,碱性高温,环境中，将反应液中Cu2+还原为亚铜离子Cu+，形成黄色的氢氧化亚铜或红色的氧化亚铜。根据显色的程度，可对尿葡萄糖作定性及半定量检测。,(CHOH),n,CHO,CH,2,OH,+,2Cu,2+,+,4OH,-,COOH,(CHOH),n,CH,2,OH,+,2CuOH,+,H,2,O,2CuOH,H,2,O,+,Cu,2,O,醛糖,醛糖酸,黄色或红色,操作步骤,20滴班氏剂,A尿液2滴 B尿液2滴,煮沸5min,煮沸5min,葡萄糖含量(g/L),试管变化,结果符号,无糖,试剂仍清晰呈蓝色，如有多量尿酸存在也可能少许蓝灰色沉淀,微量0.5以下,仅冷却后有少量绿色沉淀,+,少量0.51,煮沸约1min后，出现少量黄绿色沉淀,+,中等量12,煮沸约15s，即呈土黄色沉淀,+,多量2以上,开始煮时，即呈多量红棕色沉淀,+,【注意事项】,操作到位，,取量要准确，吸量管不能混用。,血清分离后要及时的测定以免影响实验结果。,试剂中含叠氮钠（0.95 g/L）为防腐剂。不可入口！避免接触皮肤及粘膜。应采取必要的预防措施使用试剂。,结果分析,三.测定的血糖浓度异常：,反应不彻底引起的（偏低）,葡萄糖标准溶液浓度有问题（偏高或偏低）,移液器引起的（偏高或偏低）,一.结果可报告范围：,本法对葡萄糖的检测范围为0.0622.2 mmol/L。当样品测定值超过上限时，应将样品用9 g/L氯化钠溶液作1+4稀释，重新测定，结果乘以5。,二.当样品中抗坏血酸浓度 852 mol/L，胆红素浓度 684 mol/L，血红蛋白浓度 2.00 g/L，甘油三酯浓度 22.6 mmol/L时没有观察到干扰。,本法测定葡萄糖非常特异，从原理反应式中可知第一步是特异反应，第二步特异性较差。误差往往发生在反应的第二步。一些还原性物质如尿酸、维生素C、胆红素和谷胱甘肽等，可与色原性物质竞争过氧化氢，从而消耗反应过程中所产生的过氧化氢，产生竞争性抑制，使测定结果偏低。,（1）葡萄糖O,2,H,2,O,葡萄糖酸H,2,O,2,（2）H,2,O,2,4-氨基安替吡啉苯酚,H,2,O 红色醌式物质,过氧化物酶,（POD）,Trinder反应,【讨论】,【思考题】,1.为什么要在饥饿条件下采血？,血糖主要来源是食物，进食会增高血糖浓度。,2.除糖尿病外，若血糖浓度测定结果不正常可考虑哪些原因？,注射葡萄糖、饮食、糖代谢疾病、应激反应,3.本法测定血糖为何不需制备血滤液？,血滤液除蛋白，对血糖测定没有影响。,4.为什么取血前要涂凡士林？,起润滑，防渗血作用。,