生物制药工艺学-动物细胞工程制药

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,动物细胞工程制药,本章内容,第一节 概述,第二节 动物细胞的形态和生理特征,第三节 生产用动物细胞的要求,第四节 动物细胞的培养条件和培养基,第五节 动物细胞培养的基本方法,第六节 动物细胞大量培养的方法和操作方式,第七节 动物细胞生物反应器,第八节 动物细胞产品的纯化方法和质量要求,第九节 动物细胞产品的制造实例,第十节 动物细胞制药的前景和展望,第一节 概述,细胞工程是以细胞为单位，按人们的意志，应用细胞生物学、分子生物学等理论和技术，有目的地进行精心设计，精心操作，使细胞的某些遗传特性发生改变，从而达到改良或产生新品种的目的，以及使细胞增加或重新获得产生某种特定产物的能力，从而在离体条件下进行大量培养、增殖，并提取出对人类有用的产品。,细胞工程的研究内容：,真核细胞的基因重组、导入、扩增和表达的理论和技术，细胞融合的理论和技术，细胞器特别是细胞核移植的理论和技术，染色体改造的理论和技术，转基因动植物的理论和技术，细胞大量培养的理论和技术，以及将有关产物提取纯化的理论和技术。,类型,产物,人疫苗,小儿麻痹症、狂犬、风疹、脑炎、乙肝表面抗源、疱症、某些癌症,动物疫苗,口蹄疫、鸡痘病、猪霍乱、马脑炎、牛痢疾、犬瘟、草鱼出血病、犬瘟病,酶,尿激酶、细胞色素,P450、,胃蛋白酶、胰蛋白酶、纤维蛋白溶酶原激活剂、胶原酶、酪氨酸脱羧酶,激素,促红细胞生成素、促间质细胞激素、绒膜促性腺激素、促黄体激素、促滤泡激素、生长激素,免疫调节因子,白细胞活化因子、转移抑制因子、胸腺素、白细胞介素、干扰素、血清胸腺因子、巨噬细胞毒力因子、,-,细胞生长因子,动物细胞工程培养的产物,第二节 动物细胞的形态和生理特征,一、动物细胞的形态,动物细胞的结构较原核细胞复杂得多,各种细胞有明确的分工,形态各异,原核细胞与真核细胞之区别,原核细胞,真核细胞,细胞大小,较小,较大,细胞核,无成形的细胞核，拟核，无核膜，核仁,有真正的细胞核，有核膜、核仁,细胞质,除核糖体无其它细胞器,有各种细胞器,细胞壁,有,植物、真菌有，动物细胞无,代表生物,细菌、放线菌,真菌、植物、动物,通常将离体培养的细胞分为两类,贴壁细胞（贴壁依赖型）,悬浮细胞（非贴壁依赖型）,1.,贴壁细胞,细胞的生长必须有可以贴附的支持物表面，细胞依靠自身分泌的或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长、增殖。,常见两种细胞形态：,成纤维细胞型,上皮细胞型,2.,悬浮细胞,这类细胞的生长不依赖支持物表面，可在培养液中呈悬浮状态生长，如血液的淋巴细胞和用以生产干扰素的,Namalwa,细胞等。,细胞呈圆形。,3. 兼性帖壁细胞,有些细胞不严格依赖支持物，它们既可以贴附于支持物表面生长；一定条件下，也可以在培养基中呈悬浮状态良好地生长。如中国仓鼠卵巢细胞（,CHO,细胞）、小鼠,L929,细胞。,二、,动物细胞的化学组成和代谢,动物细胞的化学组成,无机成分：水、无机盐,有机成分：蛋白质、糖类、脂类、核酸,动物细胞的代谢,糖，脂肪和蛋白质的代谢分为三个降解阶段,（大分子降解为小分子，小分子代谢产生三个主要,的中间产物，中间产物进入三羧酸循环）,三、,动物细胞的生理特点,1.,细胞的,分裂周期长,：一般,1248 h,大肠杆菌：,20 min,酵母：,2 h,2.,细胞生长需贴附于基质,，并有,接触抑制,现象,:,除少数细胞可悬浮培养外，大多数正常二倍体细胞的生长都需要在一定的基质（玻璃、塑料等）上贴附，伸展后才能生长增殖。,接触抑制,：当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片时，即每个细胞与其周围细胞相互接触时，细胞就停止增殖。此时若保持充足的营养，细胞仍可存活一段时间，但细胞密度不再增加,3.,正常二倍体细胞的生长寿命是有限的,:,时间长短决定于细胞来源的种族和年龄,当细胞离体培养开始，称为,原代培养,。原代培养细胞经传代后成为,有限细胞系,，此时即使培养条件都很理想，大多数细胞也只能生长有限时间，经若干传代后会逐渐死亡，一般不超过,50,代。当细胞突变为异倍体后，该细胞可转变成,无限细胞系,，或称连续细胞系，此时细胞的寿命是无限的。,4.,动物细胞对周围环境十分敏感,对理化因素敏感：如渗透压、,pH,、离子强度、剪切力、微量元素等。,由细胞膜结构决定。,5.,动物细胞对培养基的要求高,动物细胞：要求非常高！,12种必需氨基酸、8种以上的维生素、多种无机盐和微量元素、作为主要碳原的葡萄糖以及多种细胞生长因子和贴附因子，而且不同种类要求又有变化。,6.,动物细胞蛋白的合成途径和修饰功能与细菌不同,细菌蛋白质合成部位？,动物蛋白质合成部位？为什么有糖基化？,核糖体 高尔基体 内质网,动物细胞蛋白质合成部位,既在游离的核糖体上合成（细胞质基质蛋白），又在糙面内质网的核糖体上合成（分泌性的和膜中的融合蛋白），多数为糖蛋白。,糖链加接：内质网或高尔基体中。,蛋白质的糖基化与细胞功能密切相关。,总结：动物细胞的生理特点,细胞分裂周期长,细胞生长需贴附基质，存在接触抑制,正常二倍体细胞生长寿命有限,动物细胞对周围环境十分敏感，培养难度大,动物细胞对培养基要求高,动物细胞蛋白质合成途径和修饰功能与细菌不同,动物细胞生产药物,缺点：,培养条件高、成本贵、产量低,优点：,分泌胞外、收集纯化方便，翻译后修饰（糖基化），与天然产品一致，更适合临床使 用。,动物细胞来源的生物药物比例越来越大！,第三节 生产用动物细胞的要求和获得,一、生产用动物细胞的要求,二、生产用动物细胞的获得,三、基因工程细胞的构建和筛选,四、常用生产用动物细胞的特性,五、细胞库的建立,一、生产用动物细胞的要求,什么样的细胞可以允许用以生产人用的药品？,正常组织中分离的原代细胞：,鸡胚细胞、兔肾细胞,只要是二倍体细胞，即使经过,多次传代，如,WI-38,，,2BS,细胞,异倍体传代细胞生产重组基因产品,担心异倍体细胞的核酸会影响到人的正常染色体,按照,FDA,对细胞株的要求,严格,控制最终产品中,DNA,残留量,二、生产用动物细胞的获得,用于生产的动物细胞：,原代细胞,已建立的二倍体细胞系,可无限期传代的转化细胞系,用这些细胞进行融合和重组的工程细胞系,1.,原代细胞,直接取自动物组织、器官，经过粉碎、消化而获得的细胞悬液（,10,9,/g,）。,如鸡胚细胞、原代兔肾细胞或鼠肾细胞、淋巴细胞等。,用原代细胞生产生物制品常需要大量的动物，费钱费力。,2.,二倍体细胞系,原代细胞经过传代、筛选、克隆，从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株。,由于该类细胞寿命有限，一般从动物的胚胎组织中获取。如,WI-38,、,MRC-5,、,2BS,等曾广泛用于生产。,二倍体细胞系有正常细胞的特点,染色体组型是2n核型,贴壁依赖、接触抑制,可传代培养50代,无致瘤性,3.,转化细胞系,通过某个转化过程形成，常常由于染色体的断裂变成了异倍体，失去了正常细胞的特点，获得了无限增殖的能力。,转化过程可以是自发的、人为的（,SV40,病毒、化学试剂）。也可从直接从动物的肿瘤组织中建立。,转化细胞系具有无限生命力，常常倍增时间较短，对培养条件和生长因子等要求较低，更适于大规模工业化生产。如,Namalwa,、,CHO,、,BHK-21,、,Vero,细胞等。,中国尚未成立细胞保存中心，细胞分散保存在各研究所。,4.,融合细胞系,细胞融合,：指两个或两个以上的细胞合并成一个细胞的过程。,各种融合：动物与动物；动物与植物；植物与植物。,正常情况下，两个接触的细胞不融合。在特定诱导物作用下，细胞膜会发生一定变化，导致两个或多个细胞的融合。,细胞融合方法,（,诱导法,）,仙台病毒,融,合法,：已很少使用,聚乙二醇融合法,：目前主要用于产生单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备,细胞融合方法（物理法）,电融合法：,细胞在短时间的电场作用下，细胞膜发生可逆性的电击穿，而使相邻细胞的细胞膜相互发生继发性融合。,优点：操作简单（电融合仪），无化学毒性、对细胞损伤小、融合同步、融合率高，可在显微镜下直接观察。已成功用于多种细胞的融合。,5.,重组工程细胞系,采用基因工程的手段构建各种工程细胞。,总结：原代细胞、二倍体细胞、转化细胞系仍用于生产中，但生产中采用更多的、更有前景的是融合细胞和重组工程细胞。,三、基因工程细胞的构建和筛选,1、,真核细胞基因表达载体的构建,2、,基因载体的导入和高效表达工程 细胞株的筛选,1、,真核细胞基因表达载体的构建,病毒载体,：如牛痘病毒、腺病毒、反转录病毒和,杆状病毒,等。,质粒载体,：穿梭质粒载体,(,在细菌和哺乳动物细胞中都能扩增,),。先在细菌中构建好重组质粒，再将其转入动物细胞。,杆状病毒载体,杆状病毒表达系统,是目前国内外十分推崇的真核表达载体。,文献统计，已有,1000,余种外源基因在昆虫杆状病毒表达系统中得到了成功地表达。,病毒侵染机理,昆虫杆状病毒表达系统表达过程,杆状病毒载体,杆状病毒表达系统,是目前国内外十分推崇的真核表达载体。,文献统计，已有,1000,余种外源基因在昆虫杆状病毒表达系统中得到了成功地表达。,病毒侵染机理,昆虫杆状病毒表达系统表达过程,昆虫杆状病毒表达系统表达过程,外源基因与病毒DNA重组，获得重组病毒,重组病毒感染细胞，重组DNA进入细胞,外源基因随病毒复制而表达,杆状病毒载体,杆状病毒表达系统,是目前国内外十分推崇的真核表达载体。,文献统计，已有,1000,余种外源基因在昆虫杆状病毒表达系统中得到了成功地表达。,病毒侵染机理,昆虫杆状病毒表达系统表达过程,杆状病毒作载体的优点,该病毒基因组是双链,DNA,，容易进行重组；,插入,78kb,的,DNA,不影响正常病毒粒子的形成；,多角体蛋白和病毒粒子的形成无直接关系，因此用外源基因更换多角体蛋白基因，仍能形成有感染力的病毒粒子；,多角体蛋白基因有非常强的启动子，产生的蛋白质可占全部蛋白质的,2030%,；,用光学显微镜可看到多角体，容易以此为标记物来挑选阳性克隆（多角体被替代后看不到）；,如果用家蚕杆状病毒，还可在蚕体直接表达外源基因,。,穿梭质粒载体一般含有如下基本成分,允许载体在细菌体内扩增的质粒序列。,含有能使基因转录表达的调控元件。,能用以筛选出外源基因已整合的选择标记,。,有时还带有选择性增加拷贝数的扩增系统,。,选择标记有两种,仅适用于密切相关的突变细胞株，如标记基因,hgprt,和,tk,，分别只适用于,hgprt,-,和,tk,-,基因缺失的细胞株。,显性作用基因，如,neo,，它能使抗生素,-,新霉素失活，从而使原来对新霉素敏感的哺乳动物细胞一旦获得该基因的载体后，就能在含该抗生素的培养基中存活。,穿梭质粒载体一般含有如下基本成分,允许载体在细菌体内扩增的质粒序列。,含有能使基因转录表达的调控元件。,能用以筛选出外源基因已整合的选择标记,。,有时还带有选择性增加拷贝数的扩增系统,。,选择性增加拷贝数的扩增系统,最常用编码二氢叶酸还原酶（,DHFR,）的基因。,DHFR,的扩增可防止氨甲蝶呤（,MTX,）对细胞的毒害作用。将,DHFR,的基因与目的基因一起构建到载体中，当在培养基内增加,MTX,浓度时，就会促使,DHFR,基因的扩增，同时也会使毗邻的目的基因随之扩增，从而提高表达量。,穿梭质粒载体一般含有如下基本成分,允许载体在细菌体内扩增的质粒序列。,含有能使基因转录表达的调控元件。,能用以筛选出外源基因已整合的选择标记,。,有时还带有选择性增加拷贝数的扩增系统,。,2、,基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选,DNA,导入动物细胞的常用方法,融合法 化学法 物理法 病毒法,细胞融合法,DNA-,磷酸钙沉淀法 电穿孔法 重组逆转录病毒介导法,脂质体介导法,DEAE-,葡聚糖法 显微注射法 重组,DNA,病毒,介导法,原生质融合法 染色体介导法 基因枪法 多瘤病毒样颗粒,介导法,微细胞介导法,鬼影红细胞介导法,最普遍的两种方法,磷酸钙沉淀法,：将溶解的,DNA,加在,Na,2,HPO,4,中，逐渐加入,CaCl,2,溶液,，,当,Na,2,HPO,4,和,CaCl,2,形成,沉淀，,DNA,包裹在沉淀中，形成,DNA-,磷酸钙共沉,淀物，当沉淀物与细胞表面接触时，通过吞噬作用,将,DNA,导入胞内。,优点：方法简单，可进行共转化,电穿孔法,：借助电穿孔仪产生的高压脉冲电场，使细胞膜出现瞬时可逆性的小孔，外源,DNA,沿小孔进入细胞,。,特点：转化效率较高，,但进入的,DNA,拷贝数较低,如何筛选工程细胞,？,依靠构建载体内的选择标记采用相应的筛选系,统：,如用,HAT,（次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶）,选择系统，筛选,tk,+,、,hgprt,+,的转化细胞；用,G418,（,Geneticin,）选择系统，筛选,neo,r,的转化细胞,。,对选出的细胞进行克隆和亚克隆使其纯化。,利用扩增系统，不断增加其基因拷贝数，获得高效表达而稳定的工程细胞株。,外源基因导入动物细胞的效率很低！,四、常用生产用细胞的特性,CHO,细胞：中国仓鼠卵巢上皮样细胞。用于构建重组工程细胞系。,最为成熟和普遍表达糖基化蛋白药物的细胞。,COS,细胞：广泛用于,瞬时表达系统,。,SP2/0-Ag14：,用于单克隆抗体杂交瘤细胞的制备和抗体的生产。,BHK-21,细胞，,Vero,细胞，,Namalwa,细胞等。,五、细胞库的建立,用于生产的细胞（除原代细胞外）必须建立两个细胞库：,1.,原始细胞库,（,master cell bank,，,MCB,）,2.,生产用细胞库,（,manugactures working cell bank,，,MWCB,),或称工作细胞库（,working cell bank,，,WCB,),。,原始细胞库,是单一来源的均质的细胞，对于二倍体细胞应该是群体倍增水平尽可能低的细胞。贮存时须有该细胞的详细档案，包括：,该细胞系的历史：,来源、年龄和性别、细胞分离的方法、所用的培养材料等；,该细胞系的特性：,形态、生长的特性、种源的特性等；,对各种有害因子检查的结果。,生产用细胞库,：从原始细胞库来，或从单一安瓿来，或从多个安瓿在融化即刻混合在一起的，然后经培养扩增到一定数量后，再分装储存形成的细胞库,。,生产用细胞库也必须建立档案，而且需要进行无菌性和无细胞交叉污染的检查，生产时需确定其最高使用的传代数。,第四节 动物细胞的培养条件和培养基,培养成功必备条件：,所有与细胞接触的设备、器材和溶液，都必须保持 绝对无菌，避免细胞外微生物的污染,必须有足够的营养供应，绝对不可有有害的物质，避免即使是极微量的有害离子的掺入,保证有适量的氧气供应,需要随时清除细胞代谢中产生的有害产物,有良好的适于生存的外界环境，如,pH,、渗透压、离子浓度等,及时分种，保持合适的细胞密度,一、,动物细胞的培养条件,器材的清洗和消毒,水质,pH,渗透压,温度,空气,1.,器材的清洗和消毒,（,1,）器材的清洗：,浸泡（,3%,磷酸三钠）,刷洗,泡酸（重铬酸钾、硫酸、水）,冲洗（自来水、蒸馏水、去离子水）,（,2,）器材的消毒灭菌：,物理方法,：如紫外线、干热、湿热、过滤,化学方法,：如化学消毒剂、抗生素,细胞培养成功与否的重要环节之一：去除任何影响细胞生长的有害因子，防止外来微生物的污染。,2.,水质,细胞培养的水必须进行特殊的处理，才能使用。,除去微生物、有毒元素、金属离子、热原质,当前,处理水质的方法,有：蒸馏、离子交换、电渗透、反渗透、中空纤维过滤等,3. pH,动物细胞培养的,最适,pH,为,7.27.4,，低于,6.8,或高于,7.6,会对细胞产生不利影响，严重时可引起细胞退变甚至死亡。,培养基应具有一定的缓冲能力，必须加入缓冲系统： 如,HEPES,、,Na,2,HPO,4,/,NaH,2,PO,4,缓冲系统、,NaHCO,3,/CO,2,缓冲系统等。,4.,渗透压,动物细胞缺乏细胞壁，外界渗透压的高低波动对细胞存活有很大影响。,最理想的渗透压为,290300mOsm/kg,为调整培养液的渗透压，一般采用加减,NaCl,的方法：,1mg/ml NaCl-32mOsm/kg,在细胞培养操作中，为保持合适的渗透压和,pH,，一般都使用平衡盐溶液（,BBS,），由无机盐和葡萄糖组成。,5.,温度,动物细胞最佳培养温度,：,370.5,昆虫细胞最佳培养温度,：,27 ,温度过高：细胞退变甚至死亡,温度过低：降低代谢和生长速度，影响产量,6.,空气,方瓶和转瓶培养时，保持瓶内有足够的空间，即培养的液体量不超过总体积的,30%,。,采用生物反应器需通气，采用不同比例的,O,2,、,N,2,、,CO,2,和空气。,二、动物细胞培养基的种类和组成,天然培养基,合成培养基,无血清培养基,动物细胞对培养基的要求较高，且随着细胞的种系不同有较大差异。,1.,天然培养基,指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基，如血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸液以及羊水、腹水等。,缺点：成分复杂，制作过程复杂，组分不稳定，批间差异大，来源有限，不适于大量培养和生产的需要，逐渐为合成培养基所替代。,用成分明确的化学试剂配制成的培养基。,优点：成分明确，组分稳定，可大量生产供应,其组成大致如下：,2.,合成培养基,氨基酸：,是细胞合成蛋白质的原料。所有细胞都需要,12,种必需氨基酸：缬、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精、胱。,此外谷氨酰胺是所有细胞重要的碳源和能源。,目前商品合成培养基中含氨基酸种类最少的最 含该,13,种氨基酸的,Eagle MEM,培养基。,单纯使用合成培养基，细胞常常不能很好增殖，甚至不能贴壁。因此在使用时常常需要加入一定量的动物血清，,最常用的是,5%-10%,的动物血清,。杂瘤细胞的培养对血清要求更高，常需,10%-20%,胎牛血清。,维生素,糖类,无机盐,其它成分,还需要血清！,血清的作用机制,提供有利于细胞生长增殖所需的各种生长因子和激素,提供有利于细胞贴壁所需的贴附因子和伸展因子,提供可识别金属、激素、维生素和脂质的结合蛋白,提供细胞生长所必需的脂肪酸和微量元素,提供良好的,pH,缓冲系统,无血清培养基：合成培养基,+,不同种类的添加剂,添加剂大致有以下几类：,激素,和生长因子,：,各种激素、生长因子的功能,维持细胞的功能,保持细胞的状态（分化或未分化）,使用最多的是,胰岛素,，促进糖原和脂肪酸,的合成,，对细胞生长有刺激作用。,3.,无血清培养基,结合蛋白,：最经常被补充的是,铁传递蛋白,和,白蛋白,。,贴附和伸展因子,：目前多数无血清培养基只适用于悬浮细胞，真正能用以培养贴壁细胞的很少，也很贵，原因在于它们均缺少必需的贴附和伸展因子。,其它有利于细胞生长的因子和元素,：它们包括有消除氧自由基损害的,谷胱甘肽,，,某些微量元素,，如硒等。,无血清培养基的优点：,提高了细胞培养的可重复性，避免了由于血清批次之间差异的影响；,减少了由血清带来病毒、真菌和支原体等微生物污染的危险；,供应充足、稳定；,细胞产品容易纯化；,避免了血清中某些因素对有些细胞的毒性；,减少了血清中蛋白对某些生物测定的干扰，便于实验结果的分析。,培养细胞的种类：,原代细胞培养,传代细胞培养,培养基不同：,液体培养,固体培养,培养容器和方式不同：,静止培养,旋转培养,微载体培养,中空纤维培养,固定化培养,第五节 动物细胞培养的基本方法,不管采用哪种方法，基本方法大同小异！,一、细胞分离,离心分离法,：主要用于从含有细胞的体液，如血液、羊水、胸腹水中分离细胞，,8001000 r/min,离心,510min,消化分离法,：,将生物体的组织块剪碎,-,用,消化液,消化，使组织松散成细胞悬液,-,用缓冲液洗涤、离心、去除残留的消化液,-,获得所需细胞,消化液的用途,：取材进行原代培养时需要将组织块消化解离形成细胞悬液；传代培养时将贴壁细胞从瓶壁上消化下来。,常用的消化液,:,胰蛋白酶、乙二胺四乙酸,（,EDTA,）、,胰酶,-,柠檬酸盐、胰酶,-,EDTA,、胶原酶、链酶蛋白酶、木瓜蛋白酶等,二、细胞计数,自动细胞计数器计数,原理：,让一定体积的细胞悬液流经一个小孔，并在两个电极间通过，此时通过的细胞就会对电极间的电流产生干扰而使电压发生改变，这样就会在电子计数器上形成一个信号被记录下来。,优点：,计数速度快,缺点：,无法分辨活细胞和死细胞，误将细胞结团记录为单个细胞，使计数值偏低,血球计数,板计数,2.,血球计数板计数,台酚蓝染色：死细胞呈蓝色,苯胺黑染色,：负染色法,结晶紫染色细胞核计数法,原理：,结晶紫染液属碱性染料，低渗，有螯合钙离子的作用，可使细胞分散解离和破碎，,将细胞核染成蓝色,。染色后取样在血球计数板上镜检，计数细胞核即细胞数。,MTT,染色计数法,MTT:3-(4,，,5-,二甲基噻唑,-2)-2,，,5-,二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种,黄颜色的染料,。,原理：,活细胞内的,线粒体脱氢酶能将,MTT,转变为不可溶性的紫色的甲臜结晶,，可溶于二甲亚砜（,DMSO,）。,MTT,结晶形成的量与细胞数成正比。用酶标仪在,490nm,处测定其吸光值，可间接反映活细胞数量。,灵敏度高；,MTT,有致癌性，,DMSO,极易渗透皮肤,三、细胞传代,悬浮细胞的传代,：加入一倍或几倍的生长液，然后分种两只或多只培养瓶,贴壁细胞的传代,：先消化再分种,无论悬浮细胞或贴壁细胞的培养，细胞增殖到一定程度后，由于营养条件和代谢废物的限制，特别是贴壁细胞的接触抑制特性，细胞密度不可能无限增加，如不及时分种，细胞就会死亡、脱落。故在细胞培养中要及时传代。,贴壁细胞传代的注意事项,消化前确定细胞有无污染,加入消化液量要适当，摇动时能盖满单层细胞即可,消化时间不宜过长，室温静置,2-5min,终止消化要先去掉消化液，然后加入有血清的培养基,分种数量取决于细胞数和细胞特性，多数以,20-30,万个,/ml,，每次,1,传,2,或,1,传,3,为宜；,已培养过的瓶子可再次使用，但不要超过,2-3,次,二倍体细胞每次传代时应写上传代次数,传代后每天或隔一天换液，,3-5d,传代一次,四、细胞的冻存和复苏,1.,细胞的冻存,采用液氮低温（,-196,）冻存：加保护剂如,甘油,和,二甲亚砜,；冷冻速度以,1/min,的速度下降为宜,注意事项,：,冻存前一天换液培养；,细胞密度以,1-210,6,个,/ml,为宜；,冻存用培养基应与实际使用的一致，,DMSO,过滤除菌；,检查安踣的密封性；,标签要写上细胞名称，编号和冻存日期。,2.,细胞的复苏,（总的要求是,快融,）,注意事项,：,操作中注意防护，戴面罩和手套；,从液氮中取出后，立即丢入,37-40,温水的搪瓷杯中，并搅动加速融化；,用乙醇消毒安踣外表；,尽早除去二甲亚砜，离心，换新鲜培养液；,隔天观察细胞生长情况，再换液一次。,总结,动物细胞基本培养方法,细胞分离,细胞计数,细胞传代,细胞冻存和复苏,一、动物细胞大规模培养的方法,二、动物细胞培养的操作方式,第六节 动物细胞大量培养的方法和操作方式,一、动物细胞大规模培养的方法,悬浮培养 贴壁培养 贴壁,-,悬浮培养,1.,悬浮培养,悬浮培养,：,即让细胞自由地悬浮于培养基内生长繁殖。适用于一切种类的非贴壁依赖性细胞（悬浮细胞），也适用于兼性贴壁细胞。,优点：,操作简便，培养条件比较单一，传质和传氧较好，容易扩大培养规模，在培养设备的设计和实际操作中可借鉴细菌发酵的经验。,缺点：,细胞体积较小，较难采用灌流培养，细胞密度较低。,采用通气搅拌式生物反应器或气升式生物反应器。,2.,贴壁培养,贴壁培养：,是必须让细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培养方法。适用于一切贴壁依赖性细胞，也适用于兼性贴壁细胞。,优点：,适用的细胞种类广，较容易采用灌流培养使细胞达到高密度。,缺点：,操作麻烦，需要合适的贴附材料和足够的面积，传代或扩大培养时需先消化，培养条件不易均一，传质和传氧较差。,3.,贴壁,-,悬浮培养（假悬浮培养）,将贴壁培养和悬浮培养二者结合起来，优势互补的大规模培养方法。,微载体培养,包埋和微囊培养,结团培养,（,1,）微载体培养,微载体培养法,：将动物细胞吸附于微载体表面，在,培养液中进行悬浮培养，使细胞在微载体表面长成,单层的培养方法，或称微珠培养法。,制备微载体的材料主要有：,葡聚糖,明胶,聚苯乙烯,纤维素,等,微载体培养的优点,：既可创造相当大的贴附面积供细胞贴附生长增殖，满足绝大多数细胞的基本要求，又由于载体体积很小，比重较轻，在轻度搅拌下即可携带细胞自由悬浮在培养基内，充分发挥了悬浮培养的一切优点。,理想微载体需具备的条件,微载体表面性质与细胞有良好的相容性；,微载体的材料无毒性；,微载体的材料是惰性材料；,材料比重为,；,粒径,60-250m,（溶胀后），大小均一；,具有好的光学透明性；,基质的性质是软性的；,可耐,120,高温，便于采用,高压蒸汽灭菌；,经简单的适当处理后，可反复使用；,原料充分，制作简便，价格低廉。,从,固体微载体,发展到,多孔微载体,：极大增大了供细胞贴附的比表面积，同时还适用于悬浮细胞的培养。分两类：,一类在载体内加入钛等金属，使比重增加，适用于流化床反应器。,另一类不加钛，比重轻，可与固体微载体一样，用于搅拌罐式反应器或气升式反应器。,（,2,）包埋和微囊培养,包埋法：,将细胞包埋于各种多聚物多孔载体中的方法，有时包埋的载体较大，又称为巨载体。,微囊法：,由包埋法衍生而来，将包埋的颗粒经液化处理而成为微囊。用一层亲水的半透膜将细胞包围在珠状的微囊里，细胞不能逸出，小分子物质和营养物质可以自由出入半透膜。囊内是微小培养环境，与液体培养相似。,可用于包埋细胞的载体材料：人工合成的高分子聚合物（聚丙烯酰胺、环氧树脂等）、糖类（如纤维素、琼脂等）、蛋白质（如胶原、纤维蛋白等）。,包埋或微囊培养法的优点,包埋或包裹在载体或微囊内的细胞可获得保护，避免了剪切力的损害。,可以获得较高的细胞密度，一般都在,10,7,-10,8,个,/ml,以上。,当控制微囊膜的孔径后，可使产品浓缩在微囊内，从而有利于下游产物的纯化。,可采用多种生物反应器进行大规模培养。,（,3,）结团培养,有些正常需要贴附在基质表面的细胞有形成结团的特点。,利用细胞本身作为基质，相互贴附后，再用悬浮的方法培养，可获得高密度的细胞。,可加入直径较小的微粒促进结团,优点,：操作简便，节省了用于微载体的成本,二、动物细胞培养的操作方式,分批式操作,半连续式操作,灌流式操作,1.,分批式操作,两种情况：,将,细胞和培养基,一次性加入,反应器内进行培养，此后细胞不断增长，产物不断形成和积累，最后将,条件培养基,，即经培养已含有细胞产物的培养基，或连同细胞一并取出，培养结束。,先将细胞和培养基加入反应器，待细胞生长至一定密度后，向反应器内加入诱导剂或病毒等，经一段时间作用后，将反应物取出。,2.,半连续式操作,定义：,当细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，,每间隔一段时间,，取出部分培养物，或单纯是条件培养基，或连同细胞、载体一起，然后补充同样数量的新鲜培养基，或另加新鲜载体，继续培养。,优点：,操作简便，生产效率高，可长期进行生产，反复收获产品，而且可使细胞密度和产品产量一直保持在较高的水平。,3.,灌流式操作,定义：,当细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，,不断地将部分条件培养基取出，同时不断地补充新鲜培养基,。但细胞留在反应器内，使细胞处于一种不断的营养状态。,它与半连续式操作不同之处在于取出部分条件培养基时，,绝大部分细胞仍保留在反应器内,，而半连续式培养则同时也取出了部分细胞。,该操作方式是,近代用动物细胞培养生产各种药品最被推崇的方式。,细胞可处在较稳定的良好的环境中，营养条件好，有害代谢废物浓度低；,可极大地提高细胞密度，从而极大地提高了产品产量；,产品在罐内停留时间缩短，可及时收留在低温下保存，有利于产品质量的提高；,培养基的比消耗率较低，加之产量质量的提高，生产成本明显降低。,灌流式操作的优点,一、动物细胞生物反应器的类型及其基本结构,二、动物细胞生物反应器的检测控制系统,第七节 动物细胞生物反应器,生物反应器必备条件,制造生物反应器所采用的一切材料，尤其是与培养基、细胞直接接触的材料，对细胞必须是无毒,性的；,生物反应器的结构必须使之具有良好的传质、传热和混合,的性能；,密封性能良好，可避免一切外来的不需要的微生物,的污染；,对培养环境中多种物理化学参数能自动检测和调节控制，控制的精确度高，能保持环境质量的,均一；,可长期,连续运转；,容器加工制造时要求内面光滑，无死角，以减少细胞或微生物,的沉积；,拆装、连接和清洁方便，耐高压蒸汽消毒，便于,操作维修；,设备成本,尽可能低。,生物反应器必备条件,按规模大小可分为：,实验室规模：,20L,，用于培养工艺的研究,;,中试规模：,20100L,，提供一定量的产品，供纯化、临床前的各种检测和临床观察，也包括进一步的工艺优化实验,;,生产规模：,100L,，用于生产，提供产品。,动物生物反应器的规模,一、动物细胞生物反应器的类型及其基本结构,搅拌罐式生物反应器,气升式生物反应器,中空纤维生物反应器,固定床或流化床式生物反应器,透析袋或膜式生物反应器,搅拌罐式生物反应器,是最经典和最早被采用的一种动物细胞反应器，从细菌发酵罐借鉴而来，目前仍是大规模培养动物细胞、用以生产各种药物的主要设备。有如下特点：,罐体的,高径比一般采用11.5：1,，利于增大与空气的接触面，满足动物细胞对氧的需求；培养动物细胞的,罐底为圆形,，以避免细胞和载体沉积在周边；,为防止搅拌产生的切力损伤细胞，,搅拌速度慢,，一般在20100,r/min，,故多数倾向于采用较大的倾斜式桨叶搅拌器或船舶推进式桨叶搅拌器；,一般采用,无气泡通气系统,，以解决由于气泡破裂时产生的应力对细胞的损伤；,高密度、长时间培养以及提高反应器的生产效率考虑，反应器常常需要配备有,进出液体系统,，以便进行灌流培养，并有使细胞与培养基分离使细胞保留在反应器内的装置。,气升式生物反应器,作用原理： 气体通过反应器底部的喷射管进入反应器的导流筒，使得到流筒中的液体总体密度低于外部区域，从而一直上升，导致液体在反应器中循环。,特点：,高径比大10:1。,气泡直径12,mm,空气流速0.010.06,vvm,剪切力小，混合均一,氧和营养的传递好,有利于设备的密封,中空纤维式生物反应器,是由数百乃至数千根中空纤维集束组成的反应器，纤维壁厚为50100,m，,呈多孔性，内层为超滤膜，内腔直径为200 ,m，,两端用环氧树脂等材料将纤维粘和在一起，并使内腔开口于外加的塑料圆筒，使形成两个隔开的腔。内腔用以灌流充以氧气的培养基，外腔用以培养细胞。,该反应器占地空间小，产品产量、质量高，生产成本低。不足之处在于：不能重复使用；不能耐受高压灭菌，需用环氧乙烷或其它消毒剂灭菌；难以取样检测。,透析袋或膜式生物反应器,透析袋或膜式反应器，可将细胞培养过程中有害代谢产物透析或过滤掉，从而使细胞生长至更高密度，同时可根据需要选用不同相对分子质量的膜，使产物保留在膜内或与细胞分离开。,最简单的是将细胞置于透析袋内，并将共悬于一较大的盛有培养基的容器内，然后旋转培养，容器内的培养基可不断更换，最后透析袋内的密度可达很高。,细胞出不去，培养基可进来，有害物质可出去。,三室系统膜反应器,室与室之间的膜或采用微孔滤膜（保留细胞），或采用可截留不同相对分子质量物质的带不同大小孔径的超滤膜（保留产物）。,固定床或流化床式生物反应器,固定床反应器特点：,结构较简单，装填的材料可以是一切对细胞无毒、又有利于细胞贴附的材料，有实心载体和有孔载体两类。,实心载体：细胞只能生长在表面，密度不会太高；但比较经济，多数可重复使用。,有孔载体：细胞可进入载体内，可获得高密度。但当载体过大时，载体内的细胞常因营养物和氧的交换不充分而影响其生长和代谢。,因此，又发展出了流化床反应器。,二、动物细胞生物反应器的检测控制系统,1,、,培养过程中需检测的物化参数,培养过程中需检测的物化参数：有些需要,在线检测,，如温度、,pH,、搅拌速度、溶氧等；有些则需要,取样离线检测,，如活细胞数、氨基酸浓度分析、葡萄糖乳酸和铵离子的检测等，有些则需在,检测后计算,后才能获得，如细胞的群体倍增时间、细胞的比增长率、葡萄糖消耗率、乳酸产率、生物反应器生产率等。,2、主要参数的检测和控制方法,动物细胞培养最为重要的参数,温度,pH,溶氧,转速,进出流液量,一、动物细胞产品常用的纯化方法,二、动物细胞产品的质量要求,第八节 动物细胞产品的纯化方法和质量要求,下游纯化工作费钱、难度大,成分复杂：,工程细胞表达的产品，常常和细胞内容物、培养基成分，特别当采用有血清培养基时小牛血清中的各种蛋白成分都将与产物混杂在一起，这些成分的物化性质常常和目的产物非常相似，因此很难将他们分离开,作用于人体的药物纯度要求高：,由于产品多数用于人体，为防杂质对人体的有害作用，对产品的纯度要求很高，一般在,98%,以上,一半以上甚至,80%,资金用于中下游，即细胞培养和纯化处理中。,大多数动物细胞表达的,产物产量低，生物活性不稳定,，因此要求纯化过程中所有的操作都应该非常温和、精细，包括溶液的温度、,pH,和盐离子强度等都需要严格控制，要有相当精密的设备和检测仪器。,由于细胞产品多种多样，它们的氨基酸组成、结构、相对分子质量大小和等电点等都不尽相同，因此,分离纯化技术的通用性差,，必须根据每一种产品的特点研究开发出适合于该产品的专用的分离纯化技术。,一、动物细胞产品常用的纯化方法,离心（低温离心）,离子交换层析,凝胶层析,亲和层析,盐析和有机溶剂沉淀,透析,高压液相层析,盐析和有机溶剂沉淀,盐析：,溶液中加入无机盐类，破坏蛋白质分子周围的水化膜，使蛋白质溶解度降低而析出。,最常用的中性盐,有硫酸铵、硫酸钠和氯化钠等。调节盐浓度和,pH,常,同时使用。盐析时蛋白不易变性，结束后需要进行透析、超滤脱盐。,有机溶剂沉淀：,加入与水可混溶的有机溶剂，如乙醇、甲醇、丙酮等，也可使蛋白质沉淀。为了避免蛋白质变性必须在低温下操作。,透析,原理,：蛋白质分子较大，不能通过半透膜，可以据此将蛋白质与相对分子质量较小的杂质分开。,高压液相层析,（,HPLC,，,high-pressure liquid chromatography,）,使用颗粒极细的介质，在高压下分离蛋白质或其他分子混合物的层析技术。,柱效比经典柱色谱柱高。在色谱柱出口处常常配以高灵敏度的监测器，以及自动描记、分布收集的装置，并用计算机进行色谱条件的设定及数据处理。,二、动物细胞产品的质量要求,对工程细胞的要求：,有细胞系的历史资料,有细胞特性的资料,无细菌、真菌、支原体和各种病毒，包括反转录病毒等外来有害因子的污染,生产工艺（细胞培养和纯化工艺）的要求：,对生产厂房、原材料和试剂的要求,对细胞培养的要求,对纯化过程的要求,对产品的质量要求：,产品纯度,产品生物活性,产品比活性：,每毫克蛋白质中含有多少单位生物学,活性（,U/mg,）,产品蛋白质性质的鉴定,产品中杂质的检测,产品的稳定性,产品临床前的安全性和有效性评价,产品临床试验的安全性和有效性评价,一、改进表达载体，提高表达水平和产量,二、利用代谢工程，改进培养工艺，降低生产成本,三、抑制细胞凋亡，延长培养周期,四、采用糖基化工程，提高产品质量,五、转基因动物的研究,六、组织工程的研究,第九节 动物细胞制药的前景与展望,一、改进表达载体，提高表达水平和产量,采用更强的启动子和增强子,更好的利用扩增系统或寻找高表达位点,采用和改造更好的宿主细胞,二、利用代谢工程，改进培养工艺，降低生产成本,采用代谢工程改造工程细胞,代谢工程,，即采用基因工程的手段，使工程细胞增加或减少某种酶，改造它的代谢能力和途径，使其降低对某些营养物质的需要，减少某些代谢产物的产生和危害，以及控制工程细胞的增殖速度和制造产品的能力。,改进培养工艺，降低生产成本,优化培养工艺,三、抑制细胞凋亡，延长培养周期,细胞凋亡,：一种由遗传基因决定的程序性细胞主动死亡,防止细胞培养过程中细胞凋亡的三种措施：,通过培养基和氧的优化供应防止营养和氧的缺乏；用化学添加剂如抗氧化剂等阻断细胞凋亡过程；采用抗细胞凋亡基因改造工程细胞,四、采用糖基化工程，提高产品质量,蛋白质有两种糖基化方式：,N-,糖基化和,O-,糖基化。,O-,糖链对蛋白质特性影响不大，,N-,糖链的不同对产品可产生较大的影响。,糖基化工程：,用基因工程的手段，人为的改变肽链结构、增加某些酶基因以及改进和控制某些培养条件等，以达到正确糖基化的目的。,五、转基因动物的研究,1982年Palimiter等首次提出用转基因动物来生产药用蛋白。现有,1-抗胰蛋白酶、抗凝血酶,和蛋白C等多种产品。,优点：,质量高、成本低、产品质量基本上与天然的一样,六、组织工程的研究,组织工程：,通过对细胞的大量培养，并用细胞直接作为一种治疗手段用于临床，或用培养的细胞进一步加工构成一种组织，如人造皮肤、人造肝脏、人造胰腺、人造血管和人造骨等，并用于临床治疗。,第三章 总结,动物细胞的生理特性（识记和理解）,动物细胞的人工培养方法（识记和理解）,动物细胞工程反应器：搅拌罐式反应器、气升式反应器、中空纤维式反应器和固定床和流化床式反应器,Thank you,