生物化学与新生物技术

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,生物化学,主编 张洪渊 万海清,第十五章生物化学与新生物技术,基因组genome,基因组是生物体内全部遗传信息的集合,一个物种单倍体的一套染色体DNA,几个代表物种的基因组大小,基因组学genomics,发展和应用DNA制图、测序新技术以及计算机程序，研究生命体（包括人类）全部基因组结构及功能的学科,基因组学研究的最终目标,获得生物体全部基因组序列,鉴定所有基因的功能,明确基因之间的相互作用关系,阐明基因组的进化规律,人类基因组计划的科学意义在于：,（1）确定人类基因组中约5万个编码基因的序列及其在基因组中的物理位置，研究基因的产物及其功能。（2）了解转录和剪接调控元件的结构与位置，从整个基因组结构的宏观水平上理解基因转录与转录后调节。（3）从整体上了解染色体结构，包括各种重复序列以及非转录“框架序列”的大小和组织，了解各种不同序列在形成染色体结构、DNA复制、基因转录及表达调控中的影响与作用。（4）研究空间结构对基因调节的作用。有些基因的表达调控序列与被调节基因从直线距离上看，似乎相距甚远，但若从整个染色体的空间结构上看则恰恰处于最佳的调节位置，因此，有必要从三维空间的角度来研究真核基因的表达调控规律。,（5）发现与DNA复制、重组等有关的序列。DNA的忠实复制保障了遗传的稳定性，正常的重组提供了变异与进化的分子基础。局部DNA的推迟复制、异常重组等现象则导致疾病或者胚胎不能正常发育，因此，了解与人类DNA正常复制和重组有关的序列及其变化，将对研究人类基因组的遗传与进化提供重要的结构上的依据。,（6）研究DNA突变、重排和染色体断裂等，了解疾病的分子机制，包括遗传性疾病、易感性疾病、放射性疾病甚至感染性疾病引发的分子病理学改变及其进程，为这些疾病的诊断、预防和治疗提供理论依据。（7）确定人类基因组中转座子、逆转座子和病毒残余序列，研究其周围序列的性质。了解有关病毒基因组侵染人类基因组后的影响，可能指导人类有效地利用病毒载体进行基因治疗。（8）研究染色体和个体之间的多态性。这些知识可被广泛用于基因诊断、个体识别、亲子鉴定、组织配型、发育进化等许多医疗、司法和人类学的研究。此外，这些遗传信息,还有助于研究人类历史进程、人类在地球上的分布与迁移以及人类与其他物种之间的比较。,History of the Human Genome Project,1990 Official start of HGP with 3 billion $ and a 15 year horizon.,1999 Sanger Centre publishes chromosome 22,2001 Draft Genome published: Celera & Public,2003 Completion (almost) of Human Genome,Celera:,Craig Venter,Intl. Cons:,Francis Collins,人类基因组计划HGP,所有的标记都必须具有多态性,由于不能对人类进行“选择性”婚配，而且人类子代个体数量有限、世代寿命较长，呈共显多态性的蛋白质数量不多，等位基因的数量不多。,形态标记,细胞学标记,生化标记,DNA分子标记,遗传标记,物理图,物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”，以碱基对（bp，kb，Mb）作为基本测量单位（图距）的基因组图。,酵母第三号染色体遗传图（右）和物理图（左）的比较,策略,用机器进行自动测序，一次可读400800个碱基，由于测定的序列长度有一定限制。,克隆重叠群法,鸟枪法,克隆重叠群法,将基因组,DNA,切割长度为,0.1Mb,1Mb,的大片段，克隆到,YAC,或,BAC,载体上,然后再进行亚克隆，分别测定单个亚克隆的序列,再装配、连接成连续的,DNA,分子。,这是一种自上而下（,up to down,）,的测序策略,clone-by-clone method,鸟枪法,将较长的基因片段打断，构建一系列的随机亚克隆，然后测定每个亚克隆的序列，用计算机分析以发现重叠区域，最终对大片段的DNA定序。,全基因组鸟枪法测序主要步骤：,建立高度随机、插入片段大小为,2kb,左右的基因组文库。克隆数要达到一定数量，即经末端测序的克隆片段的碱基总数应达到基因组,5,倍以上。,高效、大规模的末端测序。对文库中每一个克隆，进行两端测序,序列集合。,填补缺口。有两种待填补的缺口，一是没有相应模板,DNA,的物理缺口，二是有模板,DNA,但未测序的序列缺口。,测序技术,Sanger双脱氧链终止法,Maxam-Gilbert化学修饰法,高通量测序技术,高通量DNA序列分析技术,人类基因组计划的成功很大程度上得益于有效减少DNA测序成本的技术更新。通过改良测序方法，不断提升其自动化程度，DNA测序的成本降低了100倍，从20世纪70-80年代,$10/bp,降低到本世纪初,$0.1/bp,！,如果一个熟练的DNA序列分析人员采取早期80年代方法每天测定,1000 bp,计算，人类基因组（约3109bp）的全序列分析，至少也得需要100名这样的工人花上100年的时间才能完成。而2000年代的高通量测序仪可达到月测序,1-6 Mbp,！,第二代测序技术, “Next Generation”, Roche 454：Pyrosequencing, Solexa/Illumina：cyclical base addition, ABI SOLiD：sequencing by ligation,Illumina / Solexa,Genome Analyzer,2000 Mb / run,Applied Biosystems,ABI 3730XL,1 Mb / day,Roche / 454,Genome Sequencer FLX,100 Mb / run,Applied Biosystems,SOLiD,3000 Mb / run,功能基因组学,在完成一个生物体全部基因组测序的基础上，详尽分析基因组的序列，鉴定基因组全部基因的功能，描述各个基因的表达和调控模式。,转录组学,研究某一特殊功能状态的细胞全套RNA的类型与拷贝数；比较不同功能状态下RNA表达的变化，搜寻与功能状态变化紧密相关的重要基因群。此研究领域的常用技术是生物芯片技术。,蛋白质组学,指蛋白质组研究领域，即研究某一特定状态的细胞全套蛋白质表达谱。此研究领域常用技术有蛋白质双向电泳、飞行质谱、蛋白质芯片技术等。,转录组,指一个细胞内的一套RNA转录物，包含了某一环境条件、某一生命阶段、某一生理或病理（功能）状态下，生命体的细胞或组织所表达的基因种类和水平。,mRNA,小RNA：miRNA、siRNA,蛋白质组,指一个细胞内的全套蛋白质，即研究某一特定状态的细胞全套蛋白质表达谱。此研究领域常用技术有蛋白质双向电泳、飞行质谱、蛋白质芯片技术等。,与基因组不同的是，转录组、蛋白质组的定义中包含了时间和空间的限定。,转录组学基本研究方法,Real-time PCR,基于杂交的转录组学方法,基因芯片,基于测序的转录组学方法,EST,全长cDNA文库,SAGE,第二代测序技术,生物信息学分析：基因表达聚类,生物芯片,在载体材料上，以大规模阵列的形式排布了不同的蛋白质或核酸等生物分子，形成可与目的靶分子相互作用，并进行反应的固相表面。,DNA芯片,通过微阵列(Microarray)技术将高密度DNA片段阵列通过高速机器人或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在固相表面，以荧光标记的DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的DNA检测,基因组芯片,表达芯片,芯片载体,玻璃片、硅片、尼龙膜、凝胶、金属,对载体进行化学修饰，活化试剂通过化学反应在载体表面键合上活性基团，以便与配基结合，形成具有生物活性的亲和表面，用于固定蛋白质和核酸,活化试剂：EDC、NHS,活性基团：氨基、环氧化物、巯基、醛基,基因芯片的探针,寡核苷酸Oligo,cDNA：PCR产物,Spotted Microarrays,cDNA,Arrays,Oligo,Arrays,In Situ Oligo Synthesis,Photosynthesis,Planer surface,Microfluidics,chip,E-field synthesis,Integrated Chips,Integrated,uF, microarray and detection chips with PCR, fluorescence or e-detection,Microfluidics,Plastics,Ceramics,Silicon,Other materials,不同的生物芯片技术平台,点样芯片,原位合成芯片,微流体芯片,整合型芯片,点样芯片,非接触式,接触式,预先合成好的探针通过类似于喷墨打印机的技术喷射到玻璃基片表面，或者用针头点在片基上。,原位合成,激光照排技术,光源,遮蔽板,芯片,array probes,A 3,3 array,CG,A,C,G,A,C,A,CG,A,G,CG,A,G,C,Nucleotide Deposition Sequence ACG,A,Mask 1,A,A,A,A,A,探针合成,array probes,A 3,3 array,C,G,A,C,G,A,C,A,C,G,A,G,C,G,A,G,C,Nucleotide Deposition Sequence ACG,C,Mask 2,C,C,C,C,C,C,A,A,A,A,A,探针合成,A 3,3 array,C,G,AC,G,AC,AC,G,A,G,C,G,A,G,C,Nucleotide Deposition Sequence ACG,G,Mask 3,C,C,C,C,C,C,A,A,A,A,A,G,G,G,G,G,G,CG,AC,G,ACG,AG,CG,AG,C,AC,探针合成,完成的芯片,L,T,L,L,L,C,L,L,L,L,L,L,L,L,A,C,T,T,T,A,C,C,C,C,C,C,G,C,C,G,A,T,A,T,C,A,T,C,A,T,C,G,A,C,G,A,A,C,T,A,C,T,A,G,C,A,G,C,T,T,O,P,O,P,O,P,O,P,O,P,O,P,O,P,O,P,O,P,O,P,O,P,O,P,L,T,L,L,L,C,L,L,L,L,L,L,L,L,A,C,T,T,T,A,C,C,C,C,C,C,G,C,C,G,A,T,A,T,C,A,T,C,A,T,C,G,A,C,G,A,A,C,T,A,C,T,A,G,C,A,G,C,T,T,O,P,O,P,O,P,O,P,O,P,O,P,O,P,O,P,O,P,O,P,O,P,O,P,L,T,L,L,L,C,L,L,L,L,L,L,L,L,A,C,T,T,T,A,C,C,C,C,C,C,G,C,C,G,A,T,A,T,C,A,T,C,A,T,C,G,A,C,G,A,A,C,T,A,C,T,A,G,C,A,G,C,T,T,O,P,O,P,O,P,O,P,O,P,O,P,O,P,O,P,O,P,O,P,O,P,O,P,For growth step: one type of monomer is coupled to specific sites deprotected using PGA.,Computer generated light irradiation patterns,样本的处理方法,按照样本分,DNA、RNA、DNA-蛋白复合体,按照标记信号分子划分,荧光染料、生物素、放射性元素,按照标记方法分,cDNA 直接标记(间接标记)、PCR扩增标记、末端标记,芯片实验流程,1、分离RNA（10,g）,2、,标记,3、杂交 （预杂交）,4、洗片,5、扫描,6、数据分析,Tagged RNA fragments flushed over array,Laser activation of fluorescent tags,Optical scanning of hybridization intensities,基因芯片的杂交实验,图像扫描,Cy5,Cy3,差异基因筛选,原理：采用cy3/cy5的ratio值对差异基因进行判断，或采用统计方法对差异基因进行统计推断。,倍数法：cy3/cy5比值大于2或者小于0.5,基因芯片的应用,基因表达谱分析,基因发现,SNP检测,药物基因组学,微生物菌种鉴定,预防医学研究,RNA-Seq,转录组测序（全转录组鸟枪法测序）：利用深度测序技术对各种类型的转录本进行高通量检测，获得RNA片段在特定样本中的含量,定量化,可以直接测定每个转录本片段序列、单核苷酸分辨率的准确度，同时不存在传统微阵列杂交的荧光模拟信号带来的交叉反应和背景噪音问题,灵敏度高，可以检测细胞中少至几个拷贝的稀有转录本,可以对任意物种进行全基因组分析，无需预先设计特异性探针，因此无需了解物种基因信息，能够直接对任何物种进行转录组分析，同时能够检测未知基因，发现新的转录本,蛋白质组学,蛋白质组：一个细胞（或组织、机体）所表达的全部蛋白质,蛋白质组学：以蛋白质组为研究对象，研究细胞内所有蛋白质及其动态变化规律的科学,本质是在大规模水平上研究蛋白质特征：,表达水平 （量）,翻译后的修饰（成熟与调控）,蛋白与蛋白相互作用（信号通路）等,由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识,蛋白质组学研究范畴,蛋白质和蛋白质间相互作用,蛋白质和核酸之间相互作用,蛋白质及其组成质点的分离、分析、鉴定,蛋白质结构分析,生理、病理或不同发育状态下蛋白质组表达差异,蛋白质信息库,研究策略与技术,两条互补的实验流程,基于凝胶的工作流程,基于液相色谱的工作流程,双向电泳（2D）,是,等电聚焦电泳,和,SDS-PAGE,的组合,即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离）,然后再进行SDS-PAGE（按照分子大小）,凝胶经染色得到二维分布的蛋白质图,第一向,IPG-IEF电泳,固相pH梯度等电聚焦（immobilized pH gradients isoelectric focusing,）,IEF是一种根据样品的等电点不同而使它们在pH梯度中相互分离的一种电泳技术,将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一定时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带,第二向垂直SDS-PAGE电泳,SDS- PAGE：,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（,Sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide gel electrophoresis,）,聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构，具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应 。SDS与蛋白质形成雪茄状带负电荷复合物，从而消除了蛋白间的电荷及形状差异，电泳速度仅与分子量有关,垂直电泳,2-DE,凝胶蛋白质斑点的检测,染色：,1）考马斯亮兰染色法；,2）银染法；,3）负染法；,4）荧光染色法；,5）放射性同位素标记法等,2-DE,凝胶蛋白质斑点的分析,图像扫描和分析,全自动斑点切取系统,2-DE,凝胶蛋白质斑点的检测,质谱,使试样中各组分电离生成不同荷质比的离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器，利用电场和磁场使发生相反的速度色散，使具有同一质荷比而速度不同的离子聚焦在同一点上，不同质荷比的离子聚焦在不同的点上，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确定其分子量,MALDI-TOF MS（基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱，Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry）,样品溶于固定的底物中形成晶体，用激光脉冲使其离子化，离子被加速后通过飞行管时分离，所有离子均可被检测,蛋白质芯片,将蛋白质固定在固相载体上，通过大分子之间的特异性识别和结合进行检测。,酶、抗原、抗体、受体、配体、细胞因子,蛋白质芯片探针,低密度蛋白质芯片：直接点样,高密度蛋白质芯片：cDNA文库所产生的几乎所有蛋白质均呈微距阵排列，点样时须用机械手进行,应用,蛋白质表达谱分析,蛋白质与蛋白质的相互作用,DNA蛋白质、RNA蛋白质的相互作用,筛选药物作用的蛋白靶点,药物筛选,