植物组织培养第6章植物的花药与花粉培养课件

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,植物组织培养,Plant tissue culture,植物组织培养,第六章,植物花药和花粉培养,第六章植物花药和花粉培养,花药培养简史,1964,年：,Guha&Maheshwari,南洋金花花药培养发育成胚。,1967,年：,Nitsch&Bourgin,花药培养获得烟草植株。,1973,年：,我国首次报道了小麦花药培养获得再生植株。,目前：,世界范围内获得单倍体植物已达,42,属,75,种以上，许多农作物及经济植物通过花粉培养都能诱导成植株。,花药培养简史1964年：Guha&Maheshwari南洋金,第一节 单倍体的概念及发生方式,一、植物单倍体的概念,1,、单倍体（,Haploid,）：,指具有配子体染色体组的孢子体。或具有配子染色体数的细胞或个体。,二、单倍体的发生方式,(4,种,),1,、孤雌生殖,：由胚囊中未受精的卵细胞发育成胚，进一步发育成单倍体植物。,2,、孤雄生殖,：在传粉后卵细胞退化消失，由精细胞单性发育成为单倍体植物。,第一节 单倍体的概念及发生方式一、植物单倍体的概念 1,3,、无融合生殖,：由胚囊中卵细胞以外的其它细胞，发育成的单倍体植株。如反足细胞、助细胞等。,4,、人工诱发单倍体途径,：,1966,年前,:,人工生产单倍体方法，有激素处理、远缘杂交、延迟受粉、用照射花粉授粉。,目前,:,离体花粉或花药培养，诱发小孢子单性发育成单倍体植物。,花药和花粉的培养,离体培养未受精的子房和胚珠，诱导卵细胞单性发育成植物体。,胚胎培养,3、无融合生殖：由胚囊中卵细胞以外的其它细胞，发育成的单倍体,1.,单核小孢子进行一次,均等分裂,形成两个等同的子细胞，而不是形成相互不同的营养细胞和生殖细胞，这两个子细胞进一步发育成愈伤组织或胚状体,。（,pathway I),2.,单核小孢子先进行一次正常的,非均等分裂,：,然后通过,营养细胞,进一步分裂形成愈伤组织或胚状体,（,pathway II),营养核退化，而,生殖核,进一步发育成单倍体植株,（,pathway III),。,两个细胞,都参与愈伤组织或胚状体的形成。,有些时候两个核融合而导致非单倍体的形成,（,pathway IV,),。,三、雄核的发育途径,1.单核小孢子进行一次均等分裂形成两个等同的子细胞，而不是形,第二节 植物花药与花粉培养,一、概念,花药与花粉培养：,指离体培养花药和花粉，使,小孢子改变原有的配子体发育途径，转向孢子体发育途径,，形成花粉胚或花粉愈伤组织，最后形成花粉植株，并从中鉴定出单倍体植株后使之二倍化的技术。,雄蕊结构：,花药,是花的雄性器官。包括花丝、花药两部分。其中花药部分由药隔（,2n,）和花粉粒,(1n),组成。,花粉粒,（也称小孢子）是由花粉母细胞经减数分裂形成。它的染色体数目为体细胞的一半，为,单倍体细胞,。,第二节 植物花药与花粉培养雄蕊结构：,Pollen mother cell,Tetrad,Pollen forming,Pollen mother cellTetradPollen,各种植物的花粉粒表面结构,各种植物的花粉粒表面结构,花药与花粉培养与单倍体植物的形成,冷处理,离体花粉,花粉培养,多核花粉,原胚,花粉胚,花粉胚,单倍体植株,愈伤组织分化,单倍体愈伤组织,花药增值,花药培养,花药,花芽,形成单倍体胚,秋水仙素处理,纯合的二倍体植株,杂合的二倍体植株,花药培养物,花粉培养,细胞培养,花药培养,器官培养,花药与花粉培养与单倍体植物的形成冷处理离体花粉花粉培养多核花,花药和花粉,培养的基本程序,外植体的选择,外植体（花蕾）预处理,外植体消毒,剥取花药,（,分离花粉粒）,接种,诱导培养,分化培养,花药和花粉培养的基本程序外植体的选择外植体（花蕾）预处理,二、材料选取,1,、花粉发育时期的选择,一般情况下，对大多数植物来说，在,单核时期,（包括单核早期、中期、晚期）的花粉比较容易培养成功。,培养花药之前，需要制片镜检，确定花粉发育时期。进行细胞学花粉发育时期的镜检,（醋酸洋红）。,(,花蕾或幼穗大小、颜色等形态学性状，瓣长,/,药长比）,四分体,单核早期,单核晚期,双核早期,双核晚期,三核期,-,小 孢 子 花 粉 粒,-,花粉培养 花药培养,二、材料选取四分体单核早期单核晚期双核早期双核晚,Pollen Development,Pollen Development,2,、基因型,供体植株遗传背景对花药和花粉培养成败至关重要。在进行花药和花粉培养时，应选择那些容易培养成功的材料来做。二棱大麦比四棱和六棱大麦愈伤组织诱导率高,小麦品种间杂种比纯种更易产生愈伤组织,.,3,、生理状态的选择,花药和花粉供体植株的生理状态，对花粉愈伤组织的诱导率也有直接的影响。不同季节接种的花药愈伤组织诱导率也有显著变化。如小麦早期接种的材料比晚期接种的材料愈伤组织诱导率可提高,2,3,倍。,2、基因型,4,、外植体预处理对花粉培养的影响,（,1,）低温度处理,：,Nitsch,（,1973,）低温处理可以明显提高花粉胚的诱导率，,3,下保存,48h,，花粉胚的诱导率提高了,33.6%,。低温处理对农作物花药培养同样有效。烟草花药,7,9,下,7,14d,为宜；水稻处理,10,、,48h,；小麦和黑麦需在,1,3,下,2,20d,得到良好效果。,低温处理的作用机理就目前来看有,两种观点：,一种认为低温可以改变花粉粒第一次,有丝分裂的纺锤体的轴向,，形成两个均等细胞，结果使得花粉朝着胚胎方向发育；另一种观点认为低温的作用是使花粉,保持了较长时间的活力,，使营养细胞得以完成细胞质的改组而转向胚胎发生。,4、外植体预处理对花粉培养的影响,（,2,）离心处理,Tanaka,（,1973,）将单核后期的烟草花药在,10000,11000r/min,的速度下离心,30min,，产生小植株的频率从,30.5%,提高,38.2%,，每个花药产生的小植株数目从对照的平均,1.6,株提高到,5.4,株。,（,3,）乙烯处理,Bennett,和,Hughes(1972),在研究小麦化学去雄时注意到，在减数分裂前用乙烯利喷施植株，促使,花粉细胞核发生分裂,。王敬驹（,1979,）在培养基中及植株上分别施加乙烯利，小麦花药培养基中较低浓度的,乙烯利（,40,80ppm,）,对花粉的愈伤组织的形成有促进作用,。,（2）离心处理 Tanaka（1973）将单核后期的烟草花,三、花药和花粉培养技术,花药培养,将发育到一定阶段的花药，培养在人工合成的培养基上，使花药内花粉粒的发育途径发生改变，形成花粉胚或花粉愈伤组织，随后由胚状体或愈伤组织分化成植株。操作程序简单，不需要游离花粉，不需要特殊培养装置。,花药培养产生的花粉植株一般有,两条途径,：,花药中的花粉通过胚状体阶段发育为小植株，例如烟草、曼佗罗等。,花粉在诱导培养基上先形成愈伤组织，再诱导分化植株。,三、花药和花粉培养技术,2,、花粉培养,从花药中游离出花粉粒，通过培养使花粉粒脱分化启动发育为单倍体植株的技术，又称,小孢子培养,。,特点,:,它可以避免花药壁、药隔及花丝等体细胞愈伤组织的干扰，可以获得大量的花粉植株，相当于单细胞培养。,1,）花粉的分离,分离法：,自然散落法,(,液体培养基培养,3-7,天,花粉开裂释放小孢子,转移培养,),、,挤压法,、,机械游离法,（磁力搅拌）。,2,）花粉培养的方式：,平板培养,：花粉在固体培养基中进行培养，使其形成花粉胚状体，最终分化为植株。,液体浅层培养,:,悬浮培养。,双层培养,：上,-,液体,+,下,-,固体。,看护培养,：花粉,-,滤纸,-,固体培养基。,微室培养,：在凹形载玻片中悬滴培养。,2、花粉培养,3,）材料消毒,花蕾用,70%,的酒精浸泡,30,秒。,无菌水清洗。,无菌吸水纸吸干花蕾表面的水分。,放入,0.1%,的氯化汞溶液中,2,4,分钟,（也可为,1%,的次氯酸钙溶液或饱和漂白粉溶液）,。,无菌水冲洗,3,5,次,用于培养花药，实际上多数未熟，由于它的外面有花萼、花瓣或颖片保护，通常处于无菌状态，所以只要将整个,花蕾或幼穗消毒,即可。,3）材料消毒,4,）培养基选择,花药培养培养基有,MS,、,N6,、马铃薯培养基、,Miller,、,Nitsch,、,B5,等。不同基因型、花药年龄等所需营养不同。,Nitsch,、,MS,常用于双子叶植物花药培养,；,N6,则用于单子叶植物花药培养。,以后研制,C,17,和,W,14,培养基，它们可以大幅度提高,小麦花药,的愈伤组织诱导率。,蔗糖,作为培养基能量物质（即碳源）及渗透压调节作用，,单子叶,植物需要,较高,浓度蔗糖（,5%,15%,）；,双子叶,植物,较低,（,3%,左右）,。,条件培养基,(conditioned medium),：指预先培养过花药的液体培养基。,例：将大麦花药接种在,N6,1.5mg/L2,，,4-D+0.5mg/LKT,，每升培养基加,100-200,枚花药，培养,1,周，除去花药的上清液为条件培养基。大麦花药培养在条件培养基上，愈伤组织诱导率由,5%,提高到,80%-90%,。,4）培养基选择,四、花粉植株的倍性,1,诱导单倍体植株的倍性,1),花药培养形成单倍体植株,。但花药中的药壁、药隔等为二倍体组织也可能被诱导发育成植株。,2,）经染色体组型分析，花药培养中发现有非单倍体植株的存在。黄佩霞（,1978,）统计,2496,株水稻花粉植株的染色体数目，其中,单倍体占,35.3%,，,二倍体占,53.4%,，多倍体和非整倍体占,5.2%,，二种或三种倍性以上混生的植株约占,6.1%,。,3,）激素对倍性变化有很大影响。,通过胚状体产生的花粉植株，几乎都是单倍体。而经过愈伤组织产的花粉植株中不少是二倍体。,愈伤组织继代培养时间愈长，二倍体的比例愈高。,四、花粉植株的倍性,2,单倍体植株的染色体加倍,1,）人工诱导染色体加倍常用化学诱导方法，有秋水仙素、富民农、对二氯苯、,8-,羟基喹啉等。,2,）,秋水仙素：,地中海生长的一种百合科,植物秋水仙的种子和球茎提取出来的物质。,溶于水、酒精，可阻止细胞有丝分裂时,纺锤丝的形成。,（,1,）,小苗浸泡加倍,：双子叶植物烟草用,0.4%,秋水仙素溶液处理,48h,，加倍率为,35%,。,（,2,）,顶芽或腋芽处理加倍,：将适宜浓度的秋水仙素水溶液，或调和在载体羊毛脂中，处理植株的顶芽或腋芽，诱导其分生组织的加倍。,（,3,）,培养基加倍,：用单倍体植株的营养体置于一种适当的培养基上，诱导形成愈伤组织，然后再放到分化培养基上，再生植株。,2 单倍体植株的染色体加倍,花粉培养,选幼年树花蕾,取下花蕾（镜检）,预培养数天,取花药,接种,分离,花粉,药壁向花粉提供营养物质；,通过药壁吸收、贮存和转化培养基中的外源物质,低温预处理,消毒,再生,花粉培养选幼年树花蕾取下花蕾（镜检）预培养数天取花药接种分离,五、例子：小麦花药培养程序,1,、,取材,：用醋酸洋红涂片镜检，选取小孢子处于单核中期的麦穗，外部形态为：旗叶叶耳与其下一叶的叶耳距为,5-15,厘米。,2,、,预处理,：将穗子用湿纱布包好，放在塑料袋中，置于,3-5,冰箱中预处理,3-5,天。,3,、,接种,：,70%,表面消毒，将叶鞘剥除，无菌条件下，将颖壳上端,1/3,剪掉，镊子将花药轻轻拿出，接种到：,N6,+2,，,4-D,（,2mg/L,）,+KT(0.5mg/L)+,蔗糖,10%,，温度,25,，暗中培养。,4,、,分化,：愈伤组织,1-2,毫米时，转入分化培养基中，,N6+2NAA,（,0.5mg/L,）,+K