实验五人淋巴细胞的培养.jsp

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验五 人类淋巴细胞株培养,培养基的配制,一、实验目的,熟练掌握,RPMI 1640,培养基的配制方法。,二、实验原理,细胞培养使用的培养基一般是由,合成培养基,和小牛血清配制而成。合成培养基有商品出售，它是根据细胞生长的需要按一定配方制成的粉状物质。其主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和其他辅助物质。它的酸碱度和渗透压与活体内细胞外液相似。,小牛血清含有一定的营养成分，更重要的是它含有细胞生长所必需的,生长因子,；,酶、微量元素和激素,；,保护作用,；,提供伸展和贴附因子,等，是合成培养基所无法替代的。此外它还能中和有毒物质（重金属、抗菌素）的毒性。,小牛血清,氨基酸是组成蛋白质的基本单位。不同种类的细胞对氨基酸的要求各异，但有几种氨基酸细胞自身不能合成，必须依靠培养基提供，这几种氨基酸称为必需氨基酸。其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。因此，各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺。但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置于,-20,冰箱中保存，在使用前加入培养液内。,L-,谷氨酰胺,三、仪器、材料和试剂,超净工作台,高压灭菌锅,多重蒸馏水器,磁力搅拌器,天平,微量加样器,（一）仪器,（二）用具、材料,细胞培养瓶,量筒、研钵、烧杯、漏斗、滤纸,pH,试纸,微孔过滤器（,0.22,m,）及,注射器,各种规格的,Tip,、,离心管,（三）试剂,NaOH,、 酚红,RPMI 1640,干粉,小牛血清、青霉素、链霉素,NaHCO,3,、,L-,谷氨酰胺,三蒸水,要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：,一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度和渗透压的调节。,二是严格控制无菌条件。,注意,四、实验步骤,（一）准备,(,清洗与灭菌）,（二）,合成培养基的配制,1. 1%,酚红：,配制,0.1 mol/L NaOH 100ml,。,称量,1g,酚红于研钵中，取,30 ml 0.1 mol/L NaOH,逐渐加入研钵中，尽量研细，然后过滤。,过滤后的酚红液加三蒸水至,100 ml,。,4,保存。,2.,饱和,NaHCO,3,的配制：,称取,10g,的,NaHCO3,溶于,200 ml,三蒸水中，灭菌后分装于,50 ml,试剂瓶。,4,保存。,3,RPMI 1640,培养液配制：,配制,50ml RPMI 1640,培养液：,每组称取,RPMI 1640,干粉,0.52g,，溶于,50 ml,的三蒸水。,置于搅拌器上搅拌,20 min,，直到液体变为澄清为止。,磁珠,4. RPMI 1640,合成培养基配制：,加入,0.1ml 1%,的酚红，通入,CO,2,，使液体变为金黄色，说明培养基完全溶好。,配制好的培养基，用时用饱和,NaHCO,3,液调节,pH,至,。,溶好以后的培养液在超净台中进行,0.22,m,滤过除菌，分装至细胞培养瓶中。,瓶口封好，,-20,或,4 ,贮存,。,（三）小牛血清的处理,新买的新生小牛血清一定要灭活。,将买来的新生小牛血清不开封置于水浴锅中,56,，,30min,，期间要不时轻轻晃动，使受热均匀，防止沉淀析出。,处理后的血清贮存于,4,。,（四）生长培养基的配制,1,双抗： （,100000U/ml,）,160,万单位青霉素,/,瓶,+8ml 3DW = 20,万单位,/ml,1g,链霉素,+5ml 3DW = 200000,g /ml,各取以上的液体,5ml,混合，使其浓度为,10,万单位,/ml,，,0.22,m,过滤至,1.5ml,离心管，,-20,贮存。,2,谷氨酰胺储备液,（,200mmol/L,）,：,1.5g,的谷氨酰胺溶于,50ml,三蒸水中,（,30 mg/ml= 200 mmol/L),0.22,m,过滤至,1.5ml,离心管中。,-20,贮存。,3,.,RPMI 1640,生长培养基的配制,50,毫升,储备液浓度,终浓度,RPMI 1640,培养液,44.5,谷氨酰胺,0.5,30mg/ml,0.3mg/ml,双抗,0.05,100000u/ml,100u/ml,小牛血清,5,10%,六、思考题：,血清在细胞培养中有何作用？,为什么配制培养基之前要反复处理配制用水并要事先高压处理？,配制培养基时调节,pH,值的目的是什么？,