(精品)动物细胞工程第四章

第四章,胚胎工程,胚胎移植技术,胚胎冷冻保存技术,胚胎分割技术,体外受精技术,20,世纪,30,年代，胚胎移植在绵羊和山羊中取得成功；,1982,年，,Brackett,等获得世界上第一胎试管犊牛，之后相继在十几种哺乳动物中获得成功；,我国，始于,20,世纪,70,年代，从牛、羊起步，,1988,年以后取得实质性进展。,定义,应用现代生物技术对哺乳动物的胚胎进行某种人为的工程技术操作，获得人们所需要的成体动物。,主要技术,胚胎移植技术,胚胎冷冻保存技术,胚胎分割技术,体外受精技术，等。,第一节胚胎移植技术,定义,将良种母畜配种后的早期,胚胎,取出，移植到,同种生理状态相同,的母畜体内，使之,继续发育,成为新个体。,意义,可充分发挥优良母畜的繁殖潜力，使良种母畜的后代数量迅速增加。,缩短世代间隔、增加选择强度，加快育种进程。,代替种畜的引进，保存品种资源。,主要,技术环节,受体的同期发情,供体的超数排卵,胚胎的采集,胚胎的检查和鉴定,胚胎的移植,供体鉴定与配种,一、同期发情和超数排卵,1,供体,受体,选择,供体,生产能力较高的优良品种,排除,病畜,卵泡发育和黄体功能,受体,繁殖性能较高的本地品种,2,、供体母畜的超数排卵,超排药物：促卵泡素（,FSH,）,前列腺素,F,2,（,PGF,2,）,以牛为例，在发情周期（发情当天为零天）的第,9,至,13,天开始肌肉注射,FSH,，,以递减剂量连续肌肉注射,4,天，每天,2,次，总剂量为,300,U,400U,，,可根据牛体重、胎次作适当调整。,绵羊和山羊超排药物量为牛的,70%,80%,为宜。,一般情况，一次发情，只排,1,个卵子。在发情周期中期，给母牛注射激素刺激大量卵泡成熟，并排卵，一次排卵的数目多到几个至十几个,3,、同期发情,同时注射前列腺素,F,2,（,PGF,2,），,一次肌肉注射。,用量：牛,0.4,mg,、,羊,0.2,mg,，。,4,、供体发情鉴定和配种,在正常情况下，供体大多在超排处理结束后,12,48,h,发情。,鉴定：接受爬跨且站立不动，辅以直肠检查。,配种：一般在发情后,8,12,h,第一次输精，以后每间隔,8,12,h,输精一次，直至发情结束。,二、胚胎采集,1,、时间,以,发情日为第零天,，在第,6,7.5,天或第,2,3,天分别从,子宫角,或,输卵管,回收胚胎。,2,、采集方法,非手术法,采用专用的二路或三路采胚管进行非手术法采胚。,手术法,输卵管冲胚,：用注射器磨钝针头刺入子宫角尖端，注入冲胚液，然后，从输卵管伞部接取冲胚液。应在排卵后,4,天内进行，冲胚液用量为,10,ml,左右。,子宫角冲胚,：从子宫角的输卵管端注入冲胚液，由基部接取。,手术法,非手术法,三、胚胎的检查及鉴定,1,捡卵,借助于实体显微镜进行。,使用进口的特制集卵杯。,2,胚胎,质量,鉴定,在,20,40,倍实体显微镜下观察受精卵的形态、色调、分裂球的大小、均匀度、细胞密度、与透明带的间隙、变性情况等。,未受精卵：卵黄未形成分裂球及细胞团。,3,胚胎,质量,分级,分,A,、,B,、,C,三个等级,A,级,B级,C级,球形胚胎、形态完整、轮廓清晰，分裂球大小均匀、结构紧凑，色调和透明度适中，无附着的细胞和液泡。,轮廓清晰，色调及细胞密度良好，可见到少量附着的细胞和液泡，变性细胞约占,10%,30%,。,轮廓不清晰，色调发暗，结构较松散，游离的细胞或液泡较多，变性细胞达,30%,50%,。,四、胚胎的移植,胚胎移植方法,手术法,非手术法,一般用于小家畜。,3,日龄以前的胚胎，移植部位为,输卵管,。将移胚管由输卵管伞插入输卵管内，把带有胚胎的液体注入。,5,日龄后的胚胎应移植到,子宫角尖端,，先用针头刺一小孔，把移胚管经刺孔插入子宫角内，将胚胎注入。,一般用于大家畜。,适用于晚期胚胎。,第二节胚胎冷冻保存技术,精子、卵母细胞和早期胚胎的冷冻保存方法是在动物细胞冷冻保存的基础上发展起来的。,胚胎冷冻保存的研究始于,20,世纪,50,年代,，,Smith,用甘油作防冻剂，保存,兔胚胎,成功。,1985,年,Rall,和,Fahy,用高浓度的,DMSO,、,乙酰胺、丙二醇和聚乙二醇分别组成,玻璃化,溶液，对,8,细胞期的小鼠胚胎进行了一步冷冻试验，获得,87.5%,的冻后发育率。,一,概念,使用特殊的保护剂和降温措施，使其长期保存在超低温环境下。,世界各国已建立了许多动物或人类的精液库或胚胎库。,胚胎冷冻保存技术可用于,建立胚胎库,、,保存动物,品种资源，,简化胚胎移植过程,，,降低引种费用,并,防止因引进活畜而传播疫病,的危险。,二,保存,原理,是一个脱水过程，冷冻保存的关键是设法减少细胞内冰晶对胚胎造成的损伤。,正常胚胎细胞内水分含量达,80%,以上，胚胎内外的水分形成冰晶，一方面对细胞本身造成机械伤害，另一方面导致未结冰的细胞内溶液渗透压急剧增高，蛋白质变性，导致胚胎死亡。,胚胎冷冻保存液中加入一定浓度的保护剂，如,甘油、,DMSO,、,乙二醇,等，可大幅度减小冷冻对胚胎的伤害。,解冻时则以较快速率升温，使胚胎瞬间通过危险温区（,500,），然后，脱险对胚胎细胞有一定伤害作用的冷冻保护剂，使胚胎存活。,玻璃化冷冻,时，由于所用溶液在低温时变黏稠，不发生结晶即可固化，形成一种特殊的“玻璃化”状态，从而使胚胎在急剧的降温过程中得以存活。,三、冷冻方法,1,、常规冷冻,目前生产中广泛采用并且最为成功的冷冻方法。,冷冻液,:,1.4mol/L,甘油,PBSS,（,含,20%,NCS,的,PBS,）,。,此方法需专用冷冻仪，可获得较高的移植妊娠率。,2,、一步冷冻法,利用高浓度的抗冻剂使胚胎在冷冻前脱水，从而减少冷冻过程中细胞内冰晶的形成。,特点,是胚胎在室温脱水后不需要特殊的降温程序，能在很短的时间内完成冷冻过程，具有重要的实用价值。,其操作程序如下：,将胚胎移入含,1.4,mol/L,甘油的,PBSS,中平衡,20,min,；,再移入含,2.1,mol/L,甘油,0.25,mol/L,蔗糖,的,PBSS,是平衡,7,min,；,装管；,将细管在液氮罐颈部（温度为,2325,）预冷,5,min,后投入液氮保存；,解冻时从液氮中取出细管，在空气中平衡,10,S,，,置于,37,水浴解冻；,脱除冷冻保护剂。,3,、玻璃化（,vitrification,）,法,目前较简单的玻璃化溶液的组成是：,25%,甘油、,25%,PROH,（,1,2-,丙二醇）或,25%,乙二醇。,其操作程序如下：,室温下，将胚胎移入含,10%,甘油的,PBSS,中平衡,10,min,；,将胚胎转移到含,10%,甘油,20%,乙二醇,的,PBSS,中；,最后将胚胎移入含,25%,甘油,25%,乙二醇的,PBSS,中，立即装管；,将细管在液氮罐颈部（温度为,2325,）预冷,5,min,后投入液氮保存；,解冻时从液氮中取出细管，在空气中平衡,7,S,，,迅速投入,20,温水中，摇动细管使其解冻均匀；,收集胚胎，将捡出的胚胎移入含,1.0,mol/L,蔗糖的,PBSS,是平衡,10,min,，,进一步脱除保护剂，再用,PBSS,洗涤胚胎,2,3,次后用于移植。,特点,:,方法简单、快速，减小冰晶对胚胎造成的损伤；,缺点,:,玻璃化溶液的浓度极高、溶质存在毒性，使胚胎的成活率降低。,四,冷冻,效果,鉴定,1,、形态学鉴定,解冻后在显微镜下观察，能恢复到冻前形态，,透明度适中,、,胚内细胞致密,、,细胞间界限清晰,。,2,染色,检查,荧光染色,生活力愈强的胚胎显示出愈强的淡绿色荧光,，死亡或生活力降低的胚胎不发荧光或仅有微弱荧光。,台盼蓝染色,3,、培养鉴定,体外培养胚胎解冻后，用含血清的,PBS,在,37,下培养,6,12,h,，,能继续发育者为存活胚胎。,异体培养将胚胎解冻后，置于结扎的兔输卵管内，在兔体内培养,12,24,h,。,再从输卵管内冲洗出来，检查发育情况，存活的胚胎能进一步发育。,4,移植,检验,将解冻后的胚胎移植给受体动物，根据受体的妊娠和产仔情况判断胚胎活力。,五,存在,问题,生产中主要采用形态学方法鉴定冻胚质量，对其移植后的发育潜力无法判断；,冷冻解冻程序比较复杂，冷冻保护剂对胚胎尚有一定的毒性；,从理论上讲，冷冻胚胎可长期保存，但对于保存过程胚胎细胞是否发生老化等问题还缺乏直接的实践证据。,第三节胚胎分割技术,一、定义,将一枚胚胎用显微手术分割为二、甚至为四或八，以获得,同卵双生,或,同卵多生,后代。,是胚胎克隆的一种方法。,二、理论依据,大多数哺乳动物早期胚胎属调整发育类型，去掉早期胚胎的一半，剩余部分仍可发育为一个完整的胚胎。,早期卵裂阶段的胚胎，至少在,8,细胞以前，每个卵裂球都有相同的发育能力。,三、分割方法,显微操作仪分割法,徒手分割法,将显微操作器械固定在显微操作仪的器械夹上，通过操纵显微操作仪完成分割操作。,显微针分割法,显微刀分割法,显微针分割法,具有较高的同卵双生率，但操作程序复杂。,该法借助于显微玻璃针分割胚胎，适用于,卵裂阶段,的胚胎。,显微刀分割法,用显微刀片对早期囊胚进行分割。,方法简便易行，主要用于,较晚阶段,的胚胎分割。,徒手分割法,在实体显微镜下手持显微刀或显微玻璃针对胚胎进行方向分割。,一般在经打磨的玻璃或塑料培养皿内进行，在含,20%,NCS,的,PBS,液滴中切割胚胎。,实体显微镜在,50,80,倍，拨动胚胎，使其对称轴与玻璃针或显微刀方向平行，置于胚胎正中部，将胚胎一分为二。,操作简便、快速，便于应用，但有灵巧的操作技能。,四、影响胚胎分割的因素,分割胚胎的,发育阶段,与透明带,的关系,胚胎发育早期，,透明带及其完整性是必要的,，其保护作用是防止胚胎与其他不相容的细胞直接接触，提高分割胚发育率，这是早期卵裂阶段的胚胎分割移植成功的关键。,操作液,一般采用含,10%,20%,血清的,PBS,液。有人认为在,12.5%,的蔗糖液中分割胚胎时，细胞发生皱缩，容易分割。,动物种类,动物种类不同，其胚胎的生物学特性有所差异；不同动物的胚胎，分割的难易程度也不同，如山羊胚胎细胞分割时，容易发生溃散。,胚胎切割的次数,对,2,、,4,、,8,细胞期的胚胎进行二分或四分割，移植后能发育为正常胎儿。,到囊胚阶段，由于内细胞团较小，一分为二后囊胚腔塌陷，故不易进行四分操作。,第四节体外受精技术,概念,通过人为操作使精子和卵子在体外环境中完成受精过程，又称试管胚技术。,基本原理,人工模拟体内环境（,营养、温度、湿度、气体、渗透压、,pH,等）使卵丘卵母细胞复合体（,COC,）,中的初级卵母细胞成熟，同时使精子获能，完成受精。,哺乳类动物体外受精的研究已有,100,多年的历史。,1878,年，,Sehenk,尝试家兔和豚鼠的体外受精。,1954,年，张民觉获得世界首例体外受精兔。,1978,年，世界首例试管婴儿诞生。,主要技术环节,卵母细胞的获取,和体外成熟,精子的,体外获能,受精卵的体外,培养和移植等,成熟卵母细胞与获能,精子的体外受精,一、卵母,细胞,的获取,活体卵巢,采集,动物经超排处理后，用剖腹术、腹腔镜技术或超声波技术等在活体动物上直接采集卵泡卵母细胞。,屠宰后,卵巢,采集,无菌采集卵巢，放入,3039,灭菌生理盐水中，,6,h,内带回实验室。,卵巢表面卵泡卵母细胞,卵巢内卵母细胞的获得,用单面刀片对卵巢深层组织进行切割，可获得,COC,。,主要来源,3,种采集方法,切割法,剥离法,抽吸法,用刀片反复切割卵泡，然后用,PBS,（,添加,5%,犊牛血清）沿切口反复冲洗卵巢，回收,COC,。,剥离突出于卵巢表面的卵泡，放在卵母细胞培养液中，然后用针刺破或用眼科剪剪破卵泡，回收,COC,。,用注射器配上,12,或,18,号针头，以,PBS,为抽卵液，从卵巢表面抽吸卵泡，将所获卵泡液直接注入检卵皿内，在显微镜下检卵；易出现不完整的,COC,及裸卵。,二、卵母细胞的成熟培养,将获得的,COC,进行分级，只有包袱,1,层以上致密卵丘细胞、形态正常的卵母细胞才可进行成熟培养。,牛卵母