章DNA的复制和修复

,第3,4,章,DNA,的复制和修复,（,DNA,Replication,and Repair,）,内,容,DNA,的复制,DNA,的损伤和修复,DNA,的突变,DNA,是生物遗传的主要物质基础，生物机体的遗传信息以密码的形式编码在,DNA,分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序，并通过,DNA,的复制由亲代传递给子代。,1953,年,Watson&Crick,提出,DNA,双螺旋结构模型后，,1958,年，,Crick,提出了,“,中心法则,”,(Central dogma),揭示了遗传信息的传递规律。,蛋白质,逆转录,翻译,转录,复制,复制,DNA,RNA,第一节,DNA,的复制,DNA,的复制：是指以原来,DNA,分子为模板合成,出相同分子的过程。,一、,DNA,的半保留复制,DNA,在复制时，两条链解开分别作为模板，在,DNA,聚合酶的催化下按碱基互补的原则合成两条与模板链互补的新链，以组成新的,DNA,分子。这样新形成的两个,DNA,分子与亲代,DNA,分子的碱基顺序完全一样。由于子代,DNA,分子中一条,链来自亲代，另一条链是新合成的，这种复制方式称为半保留复制,(semi conservative replication),。,Parental Strands,Strand,duplication,1/2 old,1/2 new,Strand separation,半保留复制的实验证明,1958,年,Meselson,和,Stahl,的实验首次有力地支持了半保留复制方式。,实验步骤：,.,大肠杆菌放在,15,NH,4,C1,培养基中生长,12,代。,.,再将细菌移到只含有,14,NH,4,C1,的培养基中,培养。,.,裂解细胞。,.,将裂解液放在,CsC1,溶液中进行密度梯度离,心。,.,在紫外光下可以看到形成的区带。,二、,DNA,复制的起点和方式,复制子,:DNA,复制从起点开始直到终点为止，每一个这样的,DNA,单位称为复制子或复制单元,(replicon),。,复制起点,:DNA,复制在生物细胞中要从,DNA,分子上特定位置开始。这个特定的位置就称为复制起点,(Origin of replication),，用,ori,表示。,复制叉,:DNA,复制的生长点形状如同分叉故称为复制叉,(replication fork),。,原核生物的染色体和质粒，真核生物的细胞器,DNA,都是环状双链分子。实验表明，它们都在一个固定的起点开始复制，复制叉移动方向大多是双向的，即形成两个复制叉或生长点，分别向两侧进行复制；,也有的是单向的，只形成一个复制叉或生长点,DNA,的双向和单向复制,复制叉,起始点,起始点,起始点,复制叉,复制叉,未复制,DNA,单向复制,双向复制,环状,DNA,复制时所形成的,q,结构,起始点,复制叉的推进,用遗传学和生物化学的方法可以确定大肠杆菌染色体,DNA,的复制起点在基因图谱上的位置。,起点,oriC,ilv,thr,0/180,Lac,att,l,25,50,75,mal,A,cys,C,try,A,his,trp,Tre,终点,大肠杆菌复制起点和终点在基因图谱上的位置,83 min,33 min,Evidence points to bidirectional replication,Label at both replication forks,DNA,复制的不同方式,A.,直线双向,B.,多起点双向,C.,型双向,D.,型单向,E.,滚动环,F.,环,A.,直线双向,三、,DNA,聚合反应有关的酶,酶,反应式,：,n,1,dATP DNA polE dAMP,n,2,dGTP +DNA dGMP,n,3,dCTP Mg,2+,dCMP,n,4,dTTP dTMP,DNA,1,DNA,的聚合反应和聚合酶,1956,年，,Kornberg,在大肠杆菌提取液中发现,DNA,聚合酶，以后陆续在不同生物中找到。,+(n,1,+n,2,+n,3,+n,4,)PPi,DNA,聚合酶的反应特点：,以四种脱氧核苷酸三磷酸,(dNTP),为底物,;,反应需要模板的指导,;,反应需要有引物,3,-OH,存在,;,DNA,链的生长方向是,53,产物,DNA,的性质与模板相同,。,DNA,聚合酶催化的链延长反应,3,5,5,3,3,5,5,3,由,DNA,聚合酶催化的,DNA,合成反应,A,B,C,D,模板,-,引物 产物,2.,大肠杆菌,DNA,聚合酶,大肠杆菌共有,5,种不同的,DNA,聚合酶：,DNA,聚合酶,，,II,，,III,，,IV,，,V,。,DNA,聚合酶,(DNA polymerase,DNA pol),理化性质：,纯化的,DNA pol,由一条多肽链组成，多肽链中含有一个锌原子。酶分子空间结构近似球体。,DNA pol,约含,1000,个氨基酸残基，,MW,为,103 kD,。经蛋白酶处理后，酶分子分裂成两个片段：大片段（,Klenow,片段）有聚合酶和,35,外切酶活性，小片段有,53,外切酶活性。,53,外切酶活性,35,外切酶活性,聚合酶,N,C,Klenow,片段,(MW68 kD),小片段,(MW35 kD),蛋白酶,功能：,聚合功能,:,通过核苷酸聚合反应使,DNA,链沿,53,方向延长。在引物,DNA,或,RNA-OH,末端，以,dNTP,为底物，按模板,DNA,上的指令由,DNApol,逐个将核苷酸加上去，就是,DNA pol,的聚合作用。酶的专一性主要表现为新进入的脱氧核苷酸必须与模板,DNA,配对时才有催化作用。,35,外切酶活性校对作用,:,这种酶活性的主要功能是从,35,方向识别和切除不配对的,DNA,生长链末端的核苷酸（对单链作用）。,53,外切酶活性就是从,53,方向水解,DNA,生长链前方的,DNA,链，主要产生,5-,脱氧核苷酸。,这种酶活性只对,DNA,上配对部分,(,双链,),磷酸二酯键有切割活力作用，方向是,53,。每次能切除,10,个核苷酸。,这种酶活性在,DNA,损伤的修复中可能起着重要作用（切除由紫外线照射而形成的嘧啶二聚体）。对冈崎片段,5,末端,RNA,引物的去除依赖此种外切酶活性。,53,外切酶活性切除修复作用,:,焦磷酸解作用,:DNApol,的这种活性可以催化,3,末端焦磷酸解,DNA,分子。,焦磷酸交换作用,:,催化,dNTP,末端的,PPi,同无机焦磷酸的交换反应。,这两种作用，都要求有较高浓度的,PPi,，因此，在体内由于没有足够高的,PPi,而无重要意义。,DNA,聚合酶,（,DNA polII),DNA,聚合酶,缺陷的突变株仍能生存，这表明,DNA pol,不是,DNA,复制的主要聚合酶。,1970,年发现了,DNApol,。此酶为多亚基，,MW 88KD,，每个细胞内约有,100,个酶分子。,催化特性,：,5,3,聚合酶活力,:,该酶催化,DNA,的聚合，但是对模板有特殊的要求。该酶的最适模板是双链,DNA,而中间有缺口,(gap),的单链,DNA,部份，而且该单链空隙部份,不长于,100,个核苷酸,。,35,外切酶活性，但无,53,外切酶活性。,该酶不是复制的主要聚合酶，因为此酶缺陷的大肠杆菌突变株的,DNA,复制都正常。,DNA,聚合酶,组成,：,DNA pol,全酶是由多种亚基组成的蛋白质，而且容易分解。现在认为它是大肠杆菌细胞内真正负责重新合成,DNA,的复制酶。,组建作用,DNA-dependent ATPase,DNA,聚合酶,两个,亚基夹住,DNA,DNA,聚合酶,异二聚体,DNA Polymerase III holoenzyme,Core,Core,b,b,b,b,b,clamps,t,2,t,subunits hold,2 cores in a dimer,g,complex,(clamp loader),g,Replication,Fork,Leading Strand synthesis,Lagging Strand synthesis,功能,A,聚合,:,以模板作指导，以四种脱氧核糖核苷酸作为底物，并且需要有,3,的引物链存在，通过核苷酸聚合反应使,DNA,链沿,5,3,方向延长。,催化脱氧核苷酸掺入,DNA,链的速率分别是,DNA,聚合酶,和,I,的,15,倍和,30,倍。,B,35,外切酶活性,大肠杆菌三种,DNA,聚合酶比较,DNA,聚合酶,分子量,每个细胞的分子统计数,5,-3,聚合酶作用,3,-5,核酸外切酶作用,5,-3,核酸外切酶作用,合成速度（核苷酸,/,分）,持续合成能力,DNA,聚合酶,103,000,400,+,+,+,1,000-1,200,3-200,88,000,100,+,+,-,2,400,1,500,830,000,10-20,+,+,-,15,000-60,000,500,000,比较项目,DNA,聚合酶,III,切除引物,修复,修复,复制,功能,聚合酶,IV,和,V:,1999,年发现,它们涉及,DNA,的错误倾向修复,(error prone repair,）,DNA,连接酶是,1967,年在三个实验室同时发现的。它是一种封闭,DNA,链上切口酶，借助,ATP,或,NAD,水解提供的能量催化,DNA,链的,5,-PO,4,与另一,DNA,链的,3-OH,生成磷酸二酯键。,这两条链必须是与同一条互补链配对结合的,(T4 DNA,连接酶除外,),，而且必须是两条紧邻,DNA,链才能被,DNA,连接酶催化成磷酸二酯键。,DNA,连接酶的主要功能就是在,DNA,聚合酶,催化聚合，填满双链,DNA,上的单链间隙后封闭,DNA,双链上的切口。这在,DNA,复制、修复和重组中起着重要的作用。,3.DNA,连接酶,(DNA ligase),连接酶连接切口,Mg,2+,连接酶,ATP,或,NAD,AMP+PPi,或,NMN+AMP,A,T,C,G,P,T,T,P,P,P,A,A,C,C,T,G,A,P,A,C,P,P,P,P,OH,T,G,G,A,T,C,G,P,T,T,P,P,P,A,A,C,C,T,G,A,P,A,C,P,P,P,T,G,G,P,切口,3,3,5,5,5,5,3,3,模板链,模板链,DNA,的一条链的复制是半不连续的,四、,DNA,的半不连续复制,冈崎片段：,1968,年，冈崎等用,3,H,脱氧胸苷标记,T4,噬菌体感染的大肠杆菌，然后通过碱性密度梯度离心法分离标记的,DNA,产物，发现短时间内首先合成的是较短的,DNA,片段，接着出现较大的分子。最初出现的,DNA,片段长度约为,1000,个核苷酸左右，称为冈崎片段（,Okzaki fragment,）。,复制叉的移动方向,解旋酶,DNA,聚合酶,III,解链酶,RNA,引物,引物体,DNA,聚合酶,I,SSB,3,3,5,前导链,滞后链,3,5,复制的,起始,DNA,链的,延长,DNA,链,终止,5,RNA,引物,3,3,RNA,引物的合成：,以,DNA,为模板，,NTP,为原料，在引物合成酶催化下，合成,10-,几十个核苷酸。,为什么？,这是保证,DNA,聚合过程高度精确的又一措施。已知,DNA,聚合酶具有,3,5,外切酶功能校对复制过程中的核苷酸,，也就是说聚合酶在开始形成一个新的磷酸二酯键前，总是检查前一个碱基是否正确，它不能从头开始合成。因此先合成一条低忠实性的多核苷酸来开始,DNA,的合成，并以核糖核苷酸来表示是,“,暂时,”,的，当,DNA,聚合以后再将其切除，以高忠实性的脱氧核苷酸取而代之，确保复制的忠实性。,核酸的拓扑结构是指核酸分子的空间结构。两条互相缠绕的双螺旋核酸分子表现出许多拓扑学的关系。在,DNA,的复制、重组、转录和组装等过程中无不牵涉到其拓扑结构的转变。,拓扑异构酶（,topoisomerase),：,DNA,在复制过程中双链需要解开。能引起,DNA,拓扑异构反应的酶为拓扑异构酶。,DNA,拓扑酶催化同一,DNA,分子不同超螺旋状态之间的转变。,五、复制中的