聚合酶链反应及其应用

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,5,2,3,4,1,6,7,8,PCR,的原理与反应条件,PCR,的,DNA,聚合酶与扩增的精确性,PCR,的模板及制备,PCR,的引物设计及合成,PCR,反应的其它控制参数,PCR,技术的衍生与发展,PCR,技术在生命科学研究中的应用,PCR,技术在临床医学方面的应用,聚合酶链反应及其应用,PCR,技术的诞生与发展,1 PCR,的原理与反应条件,PCR,技术的反应条件,PCR,技术的基本原理,PCR,反应的质量指标,PCR,技术的诞生与发展,聚合酶链反应,（,Polymerase Chain Reaction，PCR,）,又称为,PCR,扩增技术,，是一种高效、快速、特异性的体外,DNA,聚合程序。,1985年,，,美国,PE-cetus,公司人类遗传研究室的,Kary,mullis,发明了具有划时代意义的,PCR,技术；,1988年,，,美国,PE-cetus,公司推出世界上第一台,PCR,热循环仪，从而使,PCR,反应自动化；,1993年,，,Kary,mullis,因发明,PCR,技术获得,诺贝,尔化学奖；,1995年,，,定量,PCR,仪诞生，使定量研究,DNA,靶序列成为现实。,PCR,技术的基本原理,5,5,待扩增,DNA,区域,5,变性,加热,5,5,引物,退火,5,5,底物,聚合,5,5,5,5,加热,变性,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,退火 引物,底物,聚合,加热,变性,引物,退火,底物,聚合,1,2,3,5,5,5,PCR,技术的反应条件,DNA,或,RNA,模板,5,5,待扩增,DNA,区域,5,94,5,min,5,5,55,退火,5,5,聚合,5,5,5,5,5,循环,25-30,次,目标,DNA,片段达,10,6,-10,7,变性,70,DNA,引物,DNA,聚合酶,dNTPs,Mg,2+,（,缓冲液）,PCR,反应的质量指标,PCR,反应的质量标准有：,特异性（序列选择）,有效性（序列产量）,上述三大标准并非由单一因素所决定，因此在,PCR,反应中必须,准确性（序列对错）,对多种参数进行联合控制和改进，但由于,PCR,反应中的各参数往往,是相互影响的，因此任何参数的改进不可能同时满足特异性、有效,性、准确性。,PCR,扩增反应的精确性,2 PCR,的,DNA,聚合酶与扩增的精确性,用于,PCR,的,DNA,聚合酶简介,DNA,聚合酶对,PCR,精确性的重要影响,DNA,聚合酶的使用,PCR,扩增反应的精确性,利用,PCR,技术扩增,DNA,靶序列的一个重要问题是这种,DNA,体外聚,合反应的序列忠实程度，即,DNA,扩增产物序列的,准确率,。,PCR,反应的,准确率远远低于细胞内的,DNA,聚合反应，除了缺少完善的,DNA,聚合校,正系统外，影响,PCR,反应,准确率的因素还包括：,DNA,聚合酶的保真性能（主要因素）,DNA,链的物理损伤,PCR,反应体系的洁净度,DNA,聚合酶对,PCR,精确性的重要影响,DNA,聚合酶的保真性主要取决于其,3,5,的核酸外切酶活性，它,负责对错误掺入的碱基进行校正。相关研究结果表明，,DNA,聚合酶的,出错率在每轮延伸每核苷酸,1.6,X 10,6,-2.1,X 10,4,范围内。,DNA,聚合,酶的碱基掺入错误可能发生在其延伸阶段的五种活性：,与,dNTP,的结合特异性,磷酸二酯键的形成速率,焦磷酸的释放速率,碱基错误掺入之后的持续延伸性,3,5的核酸外切活性的强弱,用于,PCR,的,DNA,聚合酶简介,Taq DNA,酶的聚合出错率较高（,2.1,X10,-4,），因为它没有,3,5,的,的核酸外切酶活性和校正功能。然而通过优化反应条件，可使,Taq,酶的,聚合出错率降低到原来的,1/3,。,Taq DNA,聚合,酶催化的聚合反应的普遍,则,Taq DNA,酶还常常导致扩增产物的缺失突变。,Taq DNA,聚合酶（,Thermus aquaticus,）,错误类型是由,AT,转换为,GC,；,如果模板,DNA,具有形成二级结构的可能性,避免稀释保存,Taq DNA,聚合,酶,Taq DNA,聚合,酶在室温下也具有延伸引物的活性,Taq DNA,酶在使用时应注意：,用于,PCR,的,DNA,聚合酶简介,KlenTaq DNA,聚合酶,是一种,N,端缺失了,的,Taq DNA,聚合酶，因而,没有,5,的核酸外切酶活性；,KlenTaq DNA,聚合酶,的,Mg,2+,最佳浓度范围很宽，因此很容易优化,KlenTaq DNA,聚合酶（,Thermus aquaticus,）,在最佳反应条件下，,KlenTaq DNA,聚合酶,出错率为,5.1,X 10,5,，,性能略优于,Taq DNA,聚合酶。,反应条件；,用于,PCR,的,DNA,聚合酶简介,Tth DNA,聚合酶在,Mn,2+,的存在下，能有效地反转录长度在,1000,碱,基以下的,RNA,；,Tth DNA,聚合酶在,Mg,2+,的存在下，能由,DNA,模板合成,DNA；,Tth DNA,聚合酶（,Thermus thermophilus,）,好地克服,RNA,链中普遍存在二级结构的难题。,Tth DNA,聚合酶在较高的温度下仍具有逆转录酶活性，因此,能很,用于,PCR,的,DNA,聚合酶简介,Pfu,是一种,高保真,的,DNA,聚合酶，出错率极低；,Pfu DNA,聚合酶扩增出的产物带有平头末端；,Pfu DNA,聚合酶扩增速度极快，达,1.5-2,min/kb,；,Pfu DNA,聚合酶（,Pyrococcus furiosus,）,Pfu DNA,聚合酶的热稳定性很高。,7.0,X 10,7,-1.6,X 10,6,用于,PCR,的,DNA,聚合酶简介,Vent DNA,聚合酶具有,35,的核酸外切酶活性和校正功能，,因此,与其它,DNA,聚合酶（如,Taq,酶,）相比，具有相对较好的高保真性，其,出错率为,2.4,X 10,5,-5.7,X 10,5,；,Vent DNA,聚合酶（,Thermococcus litoralis,）,度小于,2,kb,时，扩增产物的长度与,Mg,2+,的浓度并无关联；,如果扩增长度大于,2,kb,，,则需要高于,2,mM,的,Mg,2+,，,而在扩增长,如果模板链中存在次黄嘌呤核苷或脱氧尿嘧啶核苷，,Vent,DNA,聚合酶不能延伸引物。,用于,PCR,的,DNA,聚合酶简介,DeepVent DNA,聚合酶是一种在低温和高温条件下均极其稳定的,聚合酶，且能使用广范围的辅助溶剂如甲酰胺和,DMSO,等；,DeepVent DNA,聚合酶能产生长达,14,kb,的扩增产物，其,外切酶,DeepVent DNA,聚合酶（,Pyrococcus species GB-D,）,活性,比,Vent DNA,聚合酶高,4,倍，聚合活性比,Taq DNA,酶高,5-15,倍，,度小于,2,kb,时，扩增产物的长度与,Mg,2+,的浓度并无关联；,如果扩增长度大于,2,kb,，,则需要高于,2,mM,的,Mg,2+,，,而在扩增长,如果模板链中存在次黄嘌呤核苷或脱氧尿嘧啶核苷，,Vent,DNA,聚合酶不能延伸引物。,出错率,比,Vent DNA,聚合酶低,2,倍；,用于,PCR,的,DNA,聚合酶简介,UlTma,是一种高保真的,DNA,聚合酶，可以较高的产量扩增小于,3,kb,的,DNA,靶序列，产物呈平头末端。,UITma DNA,聚合酶（,Thermotoga maritima,）,DNA,聚合酶的使用,DNA,聚合酶的标准使用范围：,1-5,Units/,m,L,特异性的改进：,在建议使用的范围内尽可能地降低酶浓度。,聚合酶的浓度是决定,PCR,反应成本的,的重要参数，浓度,过高不仅能降特异性，同时也导致不必要的消耗。,准确性的改进：,建议使用高保真的,DNA,聚合酶,PCR,模板制备与纯化,3 PCR,的模板与制备,PCR,模板的使用,粗样品中的,PCR,抑制剂,PCR,模板制备与纯化,DNA,和,RNA,均可作为,PCR,扩增反应的模板，但一般情况下，,mRNA,先逆转录成,cDNA,再进行扩增。,PCR,模板的来源主要有两大类：,纯净物,如重组质粒、制备的染色体,DNA、,回收的,DNA,片段,粗样品,如粪便、脑脊髓液、血液、食物、动物贝壳、土壤、,尿液、唾液、福尔马林固定剂、组织切片、脓汁、喷,嚏液、痰液等,上述粗样品,含有大量的,PCR,反应抑制物质，因此如何,去除,这些种类,繁多的,抑制剂,或者,添加,必要的,PCR,反应,增强剂,显得十分重要。,PCR,模板制备与纯化,从各种,粗样品中去除,PCR,反应抑制剂的程序不尽相同，但常用的,手段包括：,样品稀释,溶剂萃取（,氯仿,异戊基乙醇 491,）,乙醇沉淀,高速离心,超滤,粗样品中的,PCR,抑制剂,粪便,胆盐、胆红素（抑制浓度50,m,g/mL）,血液,亚铁血红素、聚乙醇磺酸钠、,heparin（,抗凝剂）,土壤,腐殖物质、含铁化合物,植物,硫酸右旋糖苷,食品,未鉴定的抑制剂,痰液,未鉴定的抑制剂,PCR,模板的使用,PCR,模板,的标准使用范围：,10,2,-10,5,拷贝,特异性的改进：,增加模板,DNA,的量、降低引物与模板的分子比,有效性的改进：,增加引物与模板的分子比,模板浓度的变化很大程度上取决于待扩增的碱基序列，但一般,而言，模板,DNA,长度小，,PCR,扩增产物的量就大，因此对于大分子,量的模板,DNA,（,尤其是真核生物基因组,DNA,），,在扩增之前最好先,用超声波处理或限制性酶消化,。,PCR,引物的设计原则,4,PCR,的引物设计及合成,PCR,引物的使用,引物的在线设计工具及免费软件简介,PCR,引物的设计原则,选择合适的引物是,PCR,实验设计的重要步骤，合适引物最基本的,引物的长度,标准就是与靶序列的,高特异性杂交,。为达到此目的，引物设计应注意,下列几点：,理想的引物长度应该在,18-30,个碱基之间，常见的是,20-27,个碱基,PCR,引物的设计原则,引物的,GC,含量,引物序列中的,GC,含量应在,35%-65%,之间，最好在,45%-55%,范,围内。如果因靶序列的原因，引物不得不含有,过高,的,GC,碱基，那么就,在其,5,端设计一串,A,或,T,；,同样，如果引物中的,AT,含量过高，就在其,5,端设计一串,G,或,C,，,以便将整条引物的,GC,含量控制在合适的范围内。,PCR,引物的设计原则,退火温度（,Ta）,引物的退火温度一般要比估计的相应熔点温度低,5,左右，在很多,情况下，两条引物的退火温度不尽相同，只要两者相差不到,4-,6,，,尚,不至于影响,RCR,扩增反应的产量，但它们的退火温度应在,55-75,范围,引物碱基,20,，,Ta,=4 X（G+C）+2 X（A+T）,-,5（）,内。如果两条引物的退火温度差别过大，可以适当延长,较低,Ta,值,的引,物的,3,端（这样可以保持扩增产物的长度不变）或,5,端。,引物的,Ta,值估算有多种公式，最好根据,RCR,试剂盒建议的计算方,法，例如,Alkami Quick Guide,试剂盒建议的计算方法如下：,引物碱基,20,，,Ta,=,62.5+0.41 X（GC%）,-,500/,长度,-,5（）,PCR,引物的设计原则,杜绝互补区域的存在,引物序列和靶序列各自内部应杜绝互补区域的存在。,为扩增后操作提供便利条件,在不影响扩增反应特异性的前提下，可在引物的,5,端引入诸如限,限制性内切酶识别位点、启动子序列等有用的非模板序列，以便于扩,增后操作。,PCR,引物的设计原则,引物与模板的互补程度,在一般情况下，并不要求引物与模板的序列达到,100%,互补，但