样本DNA纯化、保存方法

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,样本,DNA,提取、纯化、保存方法,一,.DNA,种类：,真核生物,DNA,、细菌,DNA,、病毒,DNA,、质粒,DNA,细胞悬液,DNA,、组织,DNA,双链环状、双链线性、单链环状,细胞核,DNA,、细胞器,DNA,二,.,提取,DNA,总的原则：,1.,保证核酸一级结构的完整性；,2.,核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；,其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；,4.,其他核酸分子，如,RNA,，也应尽量去除。,三,.DNA,样品准备,1.,生物组织：,最好新鲜组织，若不能马上提取，应贮存,70,或液氮,液氮冷冻敲碎研磨,组织匀浆法,液氮匀浆法,2.,培养细胞,悬浮生长细胞：,1500g,离心，,410,分钟收集细胞,单层培养细胞：可用刮棒或胰酶消化后离心收集,3,、血液样品,血液抗凝易用柠檬酸抗凝液（,ACD,）：,柠檬酸,0.48g,柠檬酸钠,1.32g,右旋葡萄糖,1.47g,加,H,2,O,至,100ml,每,6ml,新鲜血液加,1ml ACD,液，,0,保存数天，,-70,长期贮存。,四,.DNA,提取,1.,酚抽提法,：,先用蛋白酶,K,、,SDS,破碎细胞，消化蛋白，然后用酚和酚,-,氯仿抽提，最后乙醇沉淀。获,DNA,大小为,100,150kb,2.,甲酰胺解聚法,：,破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与,DNA,的结合，再透析获得,DNA,。可得,DNA 200kb,左右。,3.,玻璃棒缠绕法,：,用盐酸胍裂解细胞，将裂解物铺于乙醇上，然后用带钩或,U,型玻璃棒在界面轻搅，,DAN,沉淀液绕于玻棒。生成,DNA,约,80kb,。,4.,异丙醇沉淀法,：,基本同,1,法，仅用二倍容积异丙醇替代乙醇，可去除小分子,RNA,（在异丙醇中可溶状态）。,5.,表面活性剂快速制备法,：,用,Triton X-100,或,NP40,表面活性剂破碎细胞，然后用蛋白酶,K,或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。,6.,加热法快速制备,：,加热法快速制备：加热,96,100,，,5,分钟，然后离心后取上清，可用于,PCR,反应。,7.,碱变性快速制备,：,先用,NaOH,作用,20,分钟，再加,HCl,中和，离心后取上清，含少量,DNA,。,五、,DNA,的浓缩,1.,固体聚乙二醇（,PEG,）浓缩：,用透析袋外敷,PEG,至合适量。,2.,丁醇抽提浓缩：,DNA,溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇，但,DNA,不会。因此重复几次可显著减少,DNA,体积。,3.,乙醇或异丙醇沉淀：,（,1,）需要阳离子盐的存在,NaAc,最常用，,NaCl,对含,SDS,样品好，,NH,4,Ac,去除,dNTP,好，,LiCl,沉淀,RNA,好，但不能用于反转录前。,（,2,）沉淀温度与时间,0,，,10,15,分钟。,（,3,）离心,0,4,，,12000g,，,10,分钟，小于,100bp DNA,需超速离心,4,、精胺沉淀法,与,DNA,结合后使,DNA,结构凝缩沉淀，需在无盐或低盐溶液。,六,.DNA,的鉴定,1.,分光光度法,在,260nm,和,280nm,处测定,DNA,溶液的光吸收，,A,260,与,A,280,之比应在,1.75,1.80,。低于此值表明制备物中留有蛋白质成份或酚。高于此值表明有,RNA,的残留量。,2.,凝胶电泳分析,(1).,影响琼脂糖凝胶,DNA,迁移率的因素,A,、,DNA,的分子大小,分子越大迁移速度越慢,B,、琼脂糖浓度 迁移率与浓度成反比,琼脂糖含量（,W/V,）线性,DNA,分离范围（,Kb,）,0.3 5 -60,0.6 1 -20,0.7 0.8-10,0.9 0.5-7,1.2 0.4-6,1.5 0.2-3,2.0 0.1 2,C,、,DNA,构象,相同分子量的超螺旋环状（,型），切口环状（,型）和线状（,型）,DNA,，以不同速率通过凝胶，,一般情况下，迁移率,型,型,型,D,、电压,迁移率与所加电压成正比，但过大有效分离范围变小。,2Kb DNA,电压,5V/cm,。,E,、电场方向,单一方向速率均等，改变方向，极大分子,DNA,迁移更慢。通过脉冲电场凝胶电泳分离极大,DNA,。,（,2,）,.DNA,的检测,A,、用溴乙锭染色,在,254nm,紫外光下检测，如需回收最好在,300nm,紫外光下割胶，否则易脱嘌呤而断链，在,1cm,宽带上可检到,10ng DNA,。,B,、用银染法,Ag,+,与,DNA,形成复合物，在甲醛还原下可染成黑褐色，灵敏度高,200,倍，但不能回收。,（,3,）,.,分 析,通常与已知分子量的标准,DNA,片段一起电泳，经比较可获知,DNA,标本大小。如条带拖尾，系加入,DNA,量太多或凝胶未制好。如分子量小或一片糊状，表示,DNA,有降解。,为了判断目的,DNA,片段的大小，常在同一凝胶的目的,DNA,旁加一分子量参照物，同时电泳并染色后，就能在紫外灯下很快知道目的片段的大小。最常用的分子量参照物是,Hind,消化物，各片段的大小以,bp,表示，分别为：,23130,，,9416,，,6557,，,4361,，,2322,，,2027,，,564,，,125,。,（,4,）,.DNA,回收,A,、电泳到,DEAE-,纤维素膜,在所需条带前插入,DEAT-,纤维素膜，继续电泳至条带,DNA,都到膜上，取出洗下。,B,、透析袋电洗脱,切下条带的琼脂糖凝胶，放 透析袋内，加缓冲液后继续电泳，,DNA,出胶后回收。,C,、低熔点琼脂糖凝胶,切下胶，加热到,65,熔化胶，然后用酚抽提回收,DNA,。,七,.DNA,的定量,1.,分光光度法：,测定,DNA,在,A,260nm,的光吸收，计算浓度,A,260,稀释倍数,50,g/ml (,双链,DNA),A,260,稀释倍数,40,g/ml (,单链,DNA),A,260,稀释倍数,20,g/ml (,单链寡核苷酸,DNA),2.,琼脂糖平板法,：,在含溴乙锭琼脂糖平板上滴,1,5l,样品,DNA,和已知浓度标准品，放置数小时后比较检测。,3.,微型凝胶电泳：,将样品和标准品同时电泳、染色，比较荧光强度。,八,.DNA,的贮存,1.,短期贮存：,4,或,-20,存放于,TE,（,tris,和,EDTA,，,pH8,）缓冲液中。,2.,长期贮存：,在,70,乙醇，或在,DNA,溶液中加一滴氯仿，,-70,保存。,