液相色谱条件的分析和建立

按一下以編輯母片標題樣式,按一下以編輯母片本文樣式,第二層,第三層,第四層,第五層,*,液相色谱条件的分析和建立,主讲人,:,李效宽,日期,:,2010,年,11,月地点：武汉,合适的流动相,合适的色谱柱,合适的分离度,较好的色谱峰型,重现的色谱图,HPLC,分,离原理,样品组分在流动相和固定相之间进行分配，由于不同组分与固定相之间的交互作用能力(吸附.分配.离子交换.分子尺寸等)不同，使得不同组分在色谱柱上的移动速率不一样，从而产生色谱分离。(必要条件),不同类型样品的方法选择,样品,首选方法,弱极性,反相色谱,极性,正相色谱，未修饰硅胶,高分子量,凝胶色谱，尺寸排阻，离子交换,光学异构,手性柱,无机盐混合物,离子色谱,碳水化合物,氨基柱（反相），离子交换树脂,生物样品,需要特殊要求,色谱柱的选择,根据分离方式分类,(1),正相色谱：,SiO,2,；,CN,；,NH,2,(2),反相色谱：,C18,；,C4,；,C8,；,CN,；,NH,2,；苯基,(3),离子交换色谱：,阳离子官能团：,SO,3,H,磺酸基、,COOH,羧基等,阴离子官能团：,R,4,N,季铵基、-氨基等,(4),凝胶色谱：水溶性凝胶过滤（,GFC,）；,油溶性凝胶渗透（,GPC,）,(5),其它类型：手性柱等,1.,填料,基质,：硅胶,、氧化铝、聚苯乙烯等,2.,键合相,：,C4,、,C8,、,C18,、苯基、氨基、氰基等,3.,孔径：,60-100A,分子量,2000,4.,粒径：,2um-10um,5.,内径：,10mm,以下（分析），,10mm,以上（制备）,6.,长度：,100,、,150,、,250,、,300mm,色谱柱选择,色谱柱填料选择,粒度均匀（3，3.5,5,um),粒径小，柱压高，理论塔板数高，容易堵柱。,低酸度表面(硅醇基团被屏蔽），可以减少拖尾,宽的,pH,范围，可以有较大的调节自由度,色谱柱选择,长度：75,mm,150mm,250mm,压力和理论塔板正比与柱长,内径：2,mm,4.6mm,10mm,粒径：3,um,3.5um,5um,孔径：100,A,300A,流动相选择,溶 剂 截止波长,(nm),水,190,乙腈,190,甲醇,210,乙醇,210,异丙醇,210,正己烷,210,四氢呋喃,210,二氯甲烷,240,氯仿,240,甲醇和乙腈的紫外吸收图,线性范围,和检出限,度都有影,响,不同混合溶剂的粘度比较,分离度（,R1.5,）和峰型（,1.05T0.95,）,可接受的分离条件K,可以接受的分离应该是,1,k20,or 2k10 better,。,K=(t,r,-t,0,)/t,0,T,0,指 死时间，一般相当于溶剂峰出峰时间,K,与流速变化关系不大，,K,小受干扰大，,k,大则分析时间太长。,理论塔板数,分离度,w,1,w,2,是峰1峰2的基线宽度,W,0.5,1,w,0.5,2,是峰1和峰2 的半高峰宽,分离度与,k（,容量因子）的关系,所以分离的第一步就是控制1,k20,或者最好是2,k10,方法：有机相100%,90%,80%,70,每减少10%,k,值变化为2.53倍,分离度80%-70%-60%,分离度（48%-47%-46%),更换有机相,a:,甲醇-水,b:THF-,水,c:,甲醇：,THF:,水,总结,1,调节有机溶剂比例(10%)使,k,值可以接受,2 微调有机溶剂比例(1%)，使分离完全,3,更换有机溶剂,MeOH,THF,CAN,4,混合使用有机溶剂,记录每一次条件变化对谱峰的影响,其他控制选择性的因素,流动相,pH,值,柱温,不同品牌色谱柱,离子对试剂,流动相,pH,值,1,2,酸性化合物,4,5碱性化合物,3中性化合物,图中曲线的拐点为该化合物的,pKa,pH57,之间会有较好的分离，5附近比较稳定,流动相,pH,值,流动相,pH,值,pH,值的影响,(pka),一组苯甲酸,(pka=4.2),同系物的分离情况,A:pH 2.5,B:pH 3.0,C:pH 3.5,D:pH 4.0,pH,值的影响,pH,值必须在该缓冲盐的,pKa1,以内才有较好作用，超过此范围，会使得色谱条件不稳定，重复性较差,由此得出磷酸盐缓冲液可用于,醋酸盐缓冲液可用于,方式不同柱效不同,色谱条件,色谱柱：,Kromasil C18 4.6250mm 5um,，柱温：室温，波长：,203nm,流速：,1.0ml/min 2.,梯度：乙腈：水为流动相,1.,流动相：乙腈：水（,22,：,78,）为流动相,0min 20 :80,柱效,:11500 20min 40 :60,人参皂苷,Rg1,(,样品,),柱效,:60000,柱温的影响,温度变化1度，,Rt,变化13%,A:30,B:35,C:40,D:45,温度控制对定量分析很重要,更换色谱柱的影响,A C8,柱,B,苯基柱,C,氰基柱,更换色谱柱的影响,A C8,柱,B,苯基柱,C,氰基柱,由于更换色谱柱会影响峰的次序，所以这是最后的选择,流速的影响,A 3um dp,B 5um dp,C 10um dp,从左到右 1,2,4,ml/min,改变流速对分离影响不大，但可以缩短分析时间,填料及外型影响,Dp,：,2.5um,3.5um,5um,10um,（,柱压，理论塔板数）,长度：20,30,50,100,150,250,mm（,柱压，理论塔板数）,内径：2.1,3.0,3.9,4.6,mm（,线速度）,a 150mm P=1800psi,b 250mm,P=3000psi,柱长与柱压和,RT,成比例,改变粒度，长度，流速,150-mm l,3-m,，,1-mL/min,1250psi,100-mm,3-m,，,1-mL/min,825psi,100-mm,3-m 2-mL/min,1650psi,缓冲盐（离子强度调节）的影响,0,10,20,15,5,25,3000,40,mM NH,4,OAc),30,mM NH,4,OAc,20,mM NH,4,OAc,色谱柱：,Dionex acclaim C18,，,5um,，,250*4.6mm,流动相：,CH3CN:(NH4OAc,溶液,pH5.2,）,20:80,检测波长：,280nm,流速：,1.0ml/min,1050mM,浓度,检测器的影响,0,8,16,4,12,UV 220 nm,ELS detector,1,2,3,4,1,2,3,5,检测波长的影响,0,5,10,17,210 nm,246 nm,265 nm,285 nm,15,1,2,3,4,5,6,7,1.,等度条件,二,.,色谱条件的开发,2.,梯度条件,色谱条件开发的目标,二高一低：,专属性,高、准确度高、成本低是一个色谱工作者追求的目标。,在尽量短的保留时间内得到最佳的峰型、,合适,的分离度。,等度洗脱的特点,优点,操作简单、方便,重现性好,缺点,不适合某些复杂物质,梯度洗脱的特点,优点,分离能力增加,检测灵敏度提高,缺点,仪器设备要求高,不适合某些检测方式,等度和梯度获得柱效不同,色谱柱：,Dionex acclaim C18,，,250*4.6mm,，,柱温：,25,，,波长：,203nm,流速：,1.0ml/min,样品：人参皂苷,Rg1,1.,等度：乙腈：水（,22,：,78,）为流动相,2.,梯度：乙腈：水为流动相,0min 20 :80,20min 40 :60,等度和梯度获得柱效不同,柱效,2.1,万,柱效,6,万,艰难的选择,分离度,分析时间,系统压力,在三者之间作出最符合实际情况的选择,快速寻找方法的起点,传统的建立方法模式需要较长的时间，100%，90%,现代仪器多为三元或两元泵系统，可以方便的在整个流程中自由的变化比例，因此可以通过探索性梯度运行来寻找最佳方法入口。,确定梯度运行的方法,设计一个30分钟的运行，推荐条件：,250*4.6mm 5um,1.0ml/min,甲醇,0 min 5%,30 100%,35 100%,一个实例,t,g,第一个谱峰和最后一个谱峰的时间差,T,g,整个梯度运行时间,t,g,/tg0.4,梯度,t,g,/tg=,（28.6-18.3)/30=0.34，,因此可以分别尝试,由梯度变换为等度,平均保留时间,t=(18.3+28.6)/2=23.5,陡度,=(100-5)/30=3.17,等度比例,=5+3.17*23.5=79%,等度（,79%),运行结果（考虑,K?,）,由梯度变换梯度,(K?),第一个谱峰18.,3,对应,5+3.17*18.3=63%,(18.3-2.5)/2.5=6.32,6.32/3=2.1 (K=1),最后一个谱峰28.,6,对应,5+3.17*28.6=95%,梯度时间为,100-5,=,9,5-42,30,X,X=16 min,陡度不变,第二次梯度运行结果,Time B%,0 42,16 95,20 95,液相色谱的方法开发,（二）梯度方法,梯度的洗脱方式,高压梯度及低压梯度,梯度一般方法,梯度洗脱的可变参数,梯度的陡度,梯度的变化形状,如不用梯度：分离不理想,梯度条件的优化,梯度曲线的变化凹线,梯度曲线的变化凸线,梯度方法开发实例-第一步,开发一个有,9,个烷基苯酮化合物的梯度方法，用,C18,柱，在最初的条件下,(0-100%,水,-,乙腈,),，分离不理想。整个色谱峰组保留时间太长，分离度也不好。,梯度方法开发实例-第二步,为使色谱峰前移，提高起始时乙腈的比例（,50-100%,，水,-,乙腈），分离得到改善。但是,9,个化合物出了,10,个色谱峰，说明有杂质存在，很可能是流动相水中的。,梯度方法开发实例-第三步,从空白梯度图显示，在同样的色谱条件，同样的检测灵敏度下，共有两个杂质峰。说明流动相水中的杂质在此条件下可能会对检测有影响。,梯度方法开发实例-第四步,空白梯度图同样品的色谱图进行对照后，我们看到杂质（共两个峰）中的第一个小峰对第,8,个色谱峰有干扰，会使其定量分析结果不准确。,梯度方法开发实例-第五步,根据“梯度曲线下的面积越大，洗脱能力越强”的规律，试用,#5,曲线使,3-9,号峰提前,(,曲线,5,，,50-100%B),，但是小峰仍没有分出来。,梯度方法开发实例-第六步,根据“梯度曲线下的面积越大，洗脱能力越强”的规律，试用,#5,曲线使,3-9,号峰提前，改用,50-95%B,见到好的现象。,梯度方法开发实例-第七步,最后用,50-90%B,，曲线,4,，得到好的结果。,三,.,实际应用案例,色谱应用实例,欣弗,事件,色谱柱：,Eclipse XDB-C8,4.6250mm 5um,（国家标准）,流动相：,(,取磷酸二氢钾,10.54,g,，,溶于775,ml,水中，用磷酸调,pH,值至,2.5,)-,乙腈,检测波长：,210nm,柱温：25,流速：,1.0ml/min,克林霉素磷酸酯,775225,8218,色谱应用实例,欣弗,事件,色谱柱：,Eclipse XDB-C8 4.6250mm 5um,流动相：(取磷酸二氢钾10.54,g，,溶于775,ml,水中，用40%氢氧化钾调,pH,值至5.6)-乙腈(775225)为流动相,检测波长：,210nm,柱温：25,流速：,1.0ml/min,分离度大于,6,克林霉素磷酸酯,克林霉素,色谱应用实例,【,三聚氰胺,(,牛奶事件,),色谱柱：,Venusil ASB-C18,4.6*250,5um;,（,FDA,标准）,流动相：,(10mM,柠檬酸，,10mM,辛烷磺酸钠，调,pH,为,3.0),：,乙腈,=85,：,15,检测波长：,240nm,柱温：,40,流速：,1.0ml/min,分 子 式：,C3N6H6,、,C3N3(NH2)3,分 子 量：,126.12,含氮量：,66.6%,色谱应用实例（,紫杉醇,注射液,）,色谱柱：,Dionex acclaim C18,，,250*4.6mm,（黄金植物）,流动相：乙腈,-,水（,40,：,60,），洗脱至主峰出完（约