聚合酶链式反应

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第四章,聚合酶链式反应,聚合酶链反应,(Polymerase Chain Reaction,PCR),是,80,年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。,1971,年，,Khorana,提出：,DNA,经过变性，与合适引物杂交，用,DNA,聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆,tRNA,基因。,但由于测序和引物合成的困难，以及,70,年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，,Khorana,的设想被人们遗忘了,4.1 PCR,技术简史,4.1 PCR,技术简史,1985,年，美国,PE-Cetus,公司,Mullis,等人发明了聚合酶链反应（,PCR,）,基本原理是在试管中模拟细胞内的,DNA,复制,最初采用,E-coli DNA,聚合酶,I,的,Klenow,片段进行,PCR,，,4.1 PCR,技术简史,1988,年,Saiki,等从水生嗜热杆菌中提取到一种耐热,-Taq DNA,聚合酶,Taq DNA,聚合酶的应用使得,PCR,能高效率的进行，,PE-Cetus,公司推出了第一台,PCR,自动化热循环仪。,1993,年，,Mullis,因此项技术获诺贝尔化学奖,72,94,55,PCR,循环,PCR,仪,PCR,反应,4.2 PCR,反应原理,模板,DNA,变性,引物,DNA,复性,引物,DNA,延伸,PCR,双链,DNA,在受热后，配对碱基的氢键断裂，,DNA,两条链分开成为单链。,TGCATGCAT,ATCTTGAAC,TAGAACTTG,ACGTACGTA,TGCATGCAT,ATCTTGAAC,3,5,5,3,3,5,5,3,TAGAACTTG,ACGTACGTA,95,o,C,（,1,）,DNA,模板变性,模板,模板（,template,）,95,o,C,TGCATGCAT,ATCTTGAAC,3,5,5,TAGAACTTG,ACGTACGTA,3,人工合成的单链,DNA,小片断，碱基顺序分别与所要扩增的模板,DNA,双链的,5,端相同。,（,2,）,DNA,模板与引物复性,模板,模板,ATCTTGAAC,5,3,ACGTACGTA,5,3,引物,引物,引物（,primer,）,:,40-65,o,C,DNA,聚合酶按碱基配对原则延伸,DNA,链。,（,3,）,DNA,链的延伸,TGCATGCAT,ATCTTGAAC,3,5,5,TAGAACTTG,ACGTACGTA,3,模板,模板,ATCTTGAAC,5,ACGTACGTA,5,Taq,Taq,72,o,C,理论上,25-30,次循环就可以合成,2,25,-2,30,条,DNA,。,变性,复性,延伸。,（,5,）,1,个循环的结果,（,4,）新一轮循环开始,PCR,反应曲线,4.3 PCR,的过程,（,1,）第一步,变性（,denature,）,94-95,o,C,下,5,分钟，模板,DNA,双链完全变性成单链。,（,2,）第二步,复性（,anneal,）,50-60,o,C,下,1,分钟，引物与模板复性。,引物的浓度高，,引物的链短。,94,o,C,下,1,分钟，新合成的,DNA,双链又变性成单链模板。,（,4,）第四步,变性（,denature,）,72,o,C,下,1-2,分钟，,Taq DNA,聚合酶在引物的,3,端上加上核苷酸。,（,3,）第三步,延伸（,extend,）,（,5,）第五步,重复（,repeat,）,第二步,第三步,第四步,复性,延伸,变性,95,o,C 5min,50,o,C 1min,72,o,C 2min,94,o,C 1min,温度循环,需要的模板量极低。,4.4 PCR,的特点,（,1,）特异性强,PCR,使用专门合成的,DNA,引物。,延伸过程是在高温下进行。,（,2,）敏感性高,这就避免了一般,DNA,聚合酶污染和非引物延伸形成的,DNA,。提高了反映的特异性。,理论上只要一条模板链，,32,次循环就可合成约,10,9,条！,RT-PCR,：,对模板的纯度要求低。,（,5,）可以扩增,mRNA,（,4,）简便,先用逆转录酶将,mRNA,合成,cDNA,，再以,cDNA,为模板进行扩增。,（,3,）快速,整个,PCR,过程约,4,小时即可完成。,不需要纯化，甚至可以直接用细菌。已固定或包埋的组织切片也可以直接用于作模板。,4.5,标准的,PCR,反应体系,10,扩增缓冲液,10ul 4,种,dNTP,混合物 各,200umol/L,引物,10,100pmol,模板,DNA 0.1,2ug Taq DNA,聚合酶,2.5u Mg,2+,1.5mmol/L,加双或三蒸水至,100ul,自从,H.A.Erilish,分离出耐高温的,Taq DNA,聚合酶，代替大肠杆菌,DNA,聚合酶,Klenow,片断（,37,o,C),，,PCR,技术才进入实用阶段。,（,1,）,Taq DNA,聚合酶,4.6,影响,PCR,的因素,Taq DNA,聚合酶的最大特点是热稳定性，耐高温，非常适合,PCR,过程的反复高温变性要求。,热稳定性,最适温度：,72-78,o,C,延伸速度：,约,1000nt/min,酶分子,最长延伸长度：,6.7kb,最适温度高,Taq,酶的功能缺点,具有,5,3,聚合酶活性和,5,3,外切酶活性，但没有,3,5,外切酶活性。,合成超过,600bp,长度的,DNA,就有可能出现错配，用于克隆基因时必须测序。,金属离子敏感（尤其是,Mg,2+,）。,当,dNTP,（能结合,Mg,2+,）的浓度为时，,MgCl,2,的最佳浓度应是,2.0mmol/L,。,Taq DNA,聚合酶的激活剂,50mmol/L KCl,也能激活,Taq DNA,聚合酶的活性。,与待扩增的模板,DNA,区段的两,3,端序列互补（,5,端相同）的短,DNA,。,（,2,）引物（,primer),位置,3,3,即,2.75,10,11,bp,的基因组中有一次完全与,19,个核苷酸的序列相同的机会（或机会是约,2,10,-,11,）。,引物的长度,理论计算：,4,19,=2.75,10,11,。,一般引物设计为长,1530bp,。,引物的碱基序列,5,端根据需要可设计成某个内切酶的切点顺序、,RNA,聚合酶识别序列、突变位点或生物素标记等，方便与以后操作。,5ATGCAGAAACTGATCGATCGATCGAT3,3GCTAGCTACTTAAG5,3,端必须与模板正确配对，,5,端可以不配对。,template,primer,尽可能提高,G+C,含量，以提高引物与模板的结合力,引物的碱基组成,避免连续相同碱基排列或内部回文序列,.,5GGCAGTCTGCCAGTCTAC3,CTGCCAGTCTAC3,GACGG5,T,发卡结构,1,）,2,）,3,）,避免形成引物二聚体（,dimer,）,两个引物之间不能有两个以上的连续碱基序列互补。,5GGTCTGCCAGTCTAC3,3CAGGACTTAGTCACT5,primer1,primer2,Upstream primer vs Downstream primer,Sense primer vs Antisense primer,Primer1 vs Primer2,Forward primer vs Reverse primer,引物的,Tm,值,Tm=,（,G+C),4+(A+T),2,当引物中的（,G+C,）含量低于,50%,时，复性温度低于,55,o,C,。,适当提高复性温度可以提高引物与模板结合的特异性，减少非特异产物的出现。,实际复性温度选择低于,Tm,值,5,o,C,。,手工计算：,一般估计：,引物的浓度,一般使用终浓度各,0.2,mol/L,。,简并引物,如果引物的序列是从基因产物蛋白质的氨基酸序列反推出来的，就必须考虑密码的简并性。,需要合成多种序列的引物，彼此间只有一个或几个碱基差异。这样的混合引物称简并引物。,设计多组引物，结合位点依次位于前一组引物之间。增加扩增产物的特异性。,引物设计现在多用专业软件,套嵌引物（,nested primers),1,3,2,4,如,Primer5.0,等,dNTP,呈颗粒状，保存不当易变性失,dNTP,溶液呈酸性，使用时应小量分装，,-20,冰冻保存，多次冻融会,使,dNTP,降解,在,PCR,反应中，,dNTP,应为,50,200umol/L,，浓度过低会降低,PCR,产物的产量,dNTP,可与,Mg,2+,结合，使游离的,Mg,2+,浓度下降，影响,DNA,聚合酶的活性,（,3,）,dNTP,（,4,）,模,板,DNA,但不能有蛋白质变性剂、,DNA,酶、,Mg,2+,的螯合剂等影响,DNA,聚合酶的活性。,模板的量：,不能太多，,100,l,反应体系中,100ng,足够。,纯度：,PCR,对模板,DNA,的纯度要求不高。,Mg,2+,对,PCR,扩增的特异性和产量有显著的影响,在一般的,PCR,反应中，,dNTP,浓度,200umol/L,时，,Mg,2+,浓度为,1.5,2.0,mmol,/L,为宜,Mg,2+,浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低,Taq,DNA,聚合酶的活性，使反应产物减少,（,5,）,Mg,2+,一定范围内提高退火温度；,缩短退火和延伸时间，可减少错误引发及,多余的,DNA,聚合酶参与酶促延伸的机会；,降低引物和酶的浓度可以减少错误引发，,尤其是能减少引物二聚体的引发；,改变,Mg,2+,的浓度；,4.7,提高,PCR,扩增的特异性,引物设计的特异性；,减少循环次数；,热启动（,Hot Start,）,采用二对引物即外引物和内引物进行扩增来,提高扩增的特异性。,典型的引物,1,到,30,个核苷酸长,；,选择,GC,含量为,45,到,55,碱基的分布是随机的；,避免引物间和引物内产生碱基以上互补；,避免,3,末端的错误配对,；,设计,5,端和中间区为,G,或,C,的引物；,避免引物对,3,末端存在互补序列,；,避免,3,末端富含,GC,，设计引物时保证在最后,5,个核苷中含有,3,个,A,或,T,。,避免存在可能会产生内部二级结构的序列,。,4.7,引物设计的基本原则：,引物的特异性,：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性,引物量,：每条引物的浓度,0.1 1umol,或,10 100 pmolRT-PCR,引物设计特别注意：跨越两个外显子,附加序列,:,目的序列上并不存在的附加序列，如,限制位点和启动子序列,，可以加入到引物,5,端而不影响特异性。,引物,5,端修饰技术,修,饰,法,用,途,附加核酸序列：,酶切位点,克隆（如定向克隆）,噬菌体启动子,合成,RNA,探针、测序,蛋白质结合序列,产物纯化、检测,核糖体结合序列,高效表达,其它,构建载体、重组子等,4.8,聚合酶链式反应技术类型,巢式,PCR,：,是为了增加扩增的灵敏度,对已知序列设计出第一对引物,扩增,25,个循环,然后根据序列设计第二对引物,(,在第一对引物内部,),如此扩增,不受平台效应限制,灵敏度高。,选定一个温度范围，如,5035,，每个温度,2,循环，然后在,35,度,15,循环。其原理是，随着退火温度的降低，特异性逐步降低，但特异性条带在温度较高时已经扩增出来，其浓度远远超过非特异性条带，随着退火温度的降低，特异性条带优先被扩增。这种方法的退火温度范围较大，在不知道最佳退火温度时比较适合。,降落,PCR,竞争引物,PCR,：,有一个碱基变化的两种引物在较宽松的复性条件下竞争,DNA,模板，其中只有完全互补的引物才能大量配对。该法可用于测定某一,DNA,片段上是否带有某一已知碱基置换。,不对称,PCR,低浓度的引物（限制引物）首先被用完，随后只有高浓度的引物，继续合成单链,DNA,。最后产物中,99%,是单链,DNA,。,3,5,5,3,引物少