疟疾检验技术

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,疟原虫检验技术,分子生物学、血清学技术发展迅猛,但是确诊,疟疾的“金标准”,仍然是血液显微镜检查,显微镜检查是唯一可鉴别,4,种疟原虫的方法,厚薄血涂片的检查仍被认为是不可替代的疟疾诊断的金标准,实验室技术,厚薄血膜的制作,血片制作,在制作血片前，首先要核对患者的姓名、年龄和住址,取血部位和血量,采血部位,和,取血方法,：,耳垂,或无名,指，通常在耳垂取血,，,先用75%酒精棉球消毒取血部位,，,待酒精干后，用左手拇指和食指紧捏耳垂上方,或无名指指尖,，右手持消毒针迅速刺入,皮肤，,不宜过深或过浅。然后用右手中指轻轻挤压出血。,厚血膜血量约一粒米大小。,厚血膜,用推片的一角，从取血部位刮取约,4,微升血量（相当于火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接触，再由里向外一个方向旋转，转,24,圈，涂成直径,0.81,厘米大小圆形厚血膜。,薄血膜,再取一小滴血,.,将血置于第一张玻片离厚血膜适当远的地方,.,将采血玻片,(,推片,),的边缘紧贴载玻片使 血液沿边缘散开,(,如图示,).,正确的推片姿势,标准的疟疾厚薄血膜片位置,各种不同的疟疾血片涂制法：,标准血片,门诊发热病人血片,居民普查血片,厚薄血膜的标准,厚血膜血量适宜，不宜过多或过少,薄,血膜平整,无皱折和空泡,.,红细胞单层排列,血片染色,两种染色方法,:,吉氏染色法,瑞氏染色法,常用吉氏染色法,吉氏染液,(,原液,),的配置,吉氏染粉,(Azure B type)5g,甘油,(,纯,),250ml,甲醇,(,纯,),250ml,吉氏粉放入研钵中，加少量甘油充分研磨,然后边加边磨，直至甘油加完，将研磨的染液倒入棕色瓶中，在 研钵中加入少许甲醇清洗研钵，然后倒入棕色瓶中，再放入甲醇清洗，反复数次，直至甲醇用完。盖好瓶盖，将染液充分摇匀，置于室内，每天晃动数分钟，存放一周后经过滤即可使用。保存时间越长染色效果越好。,整个染色液配制时间不能少于,5,个小时,稀释,吉氏原液,原液需经,pH7.0,盐酸缓冲液（,PBS,）或净水稀释后，方可用于厚薄血片染色。,吸取母液时，不要晃动瓶子,以免沉淀物泛起影响染色效果,.,操作,1,（快染）,配制,5%,染液，（每张血片约需染液,2ml,）,：量筒内量,2ml,缓冲液或净水，直接滴加吉氏原液,7,滴，混匀，滴入待染标本的厚薄血膜上，染色,10min,，清水细缓冲洗，晾干镜检。,操作,2 (,慢染,),在染色量筒内量,2ml,蒸馏水或净水，再滴加,吉氏原液,4,滴，混匀，,滴入待染标本上，,染色,3040min,。清水细缓冲洗，,晾干镜检。,吉氏染液浓度,门诊染色,将已用甲醇固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入,3%,吉氏染液稀释液（,3,毫升吉氏原液加缓冲液或净水,97,毫升，混匀）浸没血片，同时对厚薄血膜染色30,min,（根据当地实际情况，酌情增减染色时间和浓,度），然后用清水轻轻将染液漂洗干净，将血片标,本（血膜面朝下）插于晾干板上晾干，包装，镜,检。,成批血片染色,质量好的染色,:,核呈红色,胞浆呈蓝色,如果血片偏红,说明染液偏酸性,如果血片偏蓝,说明染液偏硷性,外观吉氏染色血片,染色过程,将血片平置于染色板上。,用吸管吸取已稀释的吉氏液约,2ml,于厚薄血,膜上，染色,10 min,。,用清水细缓冲去染液。,置玻片于插板上，自然晾干。,血片干燥后,用甲醇固定薄血膜。,血片制作与染色注意事项,使用前载玻片一定要清洁，不然会影响 血片制作和镜检结果,厚血膜干燥时不要加热，加热会使原虫变形，影响镜检结果,配置母液时过滤可除去杂质颗粒，有助于提高镜检质量,固定薄血膜时不要将甲醇触碰到厚血膜,冲洗染液时，不要冲走厚血膜。,原虫密度计算,估计疟原虫感染程度有三种方法：,半定量计数法 检查厚血膜,白细胞原虫密度计数法检查厚血膜,红细胞感染率计算法检查薄血膜,用厚血膜每个视野中所观察到疟原虫的平均数粗略地估计出疟原虫密度。这种方法简便，缺点是计数的疟原虫数受血膜厚薄影响，只能定性，不宜作定量分析。,国内常用。此方法将密度分为,6,级：,1.,全厚血膜查见疟原虫数在,10,个以内，记录实际数字,2.,全厚血膜查见疟原虫数在,10,个以上，但平均每个视野不到,1,个虫，记录“少”,3.,平均每个视野,15,个虫，记录“”,4.,平均每个视野,610,个虫，记录“,+”,5.,平均每个视野,11100,个虫，记录“,+”,6.,平均每个视野,100,个虫以上，记录“,+”,。,半定量计数法,白细胞疟原虫密度计数法（,WHO,推荐）,白细胞疟原虫密度计数法重要性,用于疟疾研究,用于临床诊断,用于抗疟后疟疾考核,在厚血膜，按要求选择视野，计数,200,个白细胞中的疟原虫数（可分有性体和无性体），如果原虫密度较低，可增加白细胞计数（,500 1 000,个）。,白细胞疟原虫计算公式：,疟原虫数,患者每微升血的白细胞数,计数的白细胞数,=,疟原虫数,/,l,血。,如果不知患者的白细胞数，则每微升血以,8 000,个白细胞计数,(,国际标准,),。,白细胞疟原虫密度计数法（,WHO,推荐）,白细胞疟原虫计数法举例,假设计数,200 WBC,中有,35,个疟原虫，在不知患,者白细胞数的情况下，以每微升血,8000,个白细,胞为数,由此计算出每微升血液疟原虫密度为,：,35,（原虫数）,x 8000,200,（白细胞数）,=1400/,l,答：该患者原虫密度为,1400/,l,。,薄血膜不同区域的红细胞疟原虫感染率有较大差别，通常血膜后端和边缘部疟原虫密度常比前半部或中央部高，所以，镜检时不宜只检查一个角落，应顺玻片的横轴检查。,镜检时，应当记录下所观察到的各种疟原虫虫期，不要笼统地记录为,Pv,或,Pf,。,红细胞感染率计算法（薄血膜）,1.,按以下公式计算：,红细胞原虫感染率（,%,）,=,疟原虫数,X 100,计数的红细胞数,2.,显微镜下选择红细胞排列整齐密集，无重迭的视野（,300-500,红细胞,/,视野）,3.,按一定顺序移动血片记数红细胞的同时，记录疟原虫数,4.,如果能见到疟原虫，但是记数,5000,10000,个红细胞时却没有感染红细胞，那么设定感染率为,红细胞感染率计算法（薄血膜）,如何确定疟原虫血片为阴性,检查全部厚血膜未查见疟原虫,最少检查,100,个厚血膜油镜视野未查见,疟原虫,人类四种疟原虫的 基 本特征,感染人的疟原虫有四种,:,恶性疟原虫,P.,falciparum,间日疟原虫,P.,vivax,三日疟原虫,P.,malariae,卵形疟原虫,P.,ovale,恶性疟,P.falciparum,四种疟原虫中致病力最强,无免疫力者感染后出现急性症状,不及时治,疗可危及生命,在我国主要流行云南省和海南省,间日疟,P.vivax,间日疟原虫分布于我国大部分地区，,主要是中部地区,引起间日疟,病程呈良性,但有复发,三日疟,P.malariae,三日疟在我国已基本消灭,主要发生在晚秋及初冬,无复发,卵形疟,P.ovale,又称蛋形疟原虫,在我国已基本消灭,引起症状与间日疟相似,但很少复发,四种疟原虫的 诊断要点,环状体钎细,红细胞不涨大,一个红细胞内可有几个环状体,环状体内可有,2,个核,环状体可贴在红细胞边缘,血片中没有其他发育期滋养体,配子体呈新月形或腊肠形,可出现茂氏点,恶性疟（,P.falciparum,）鉴定 要点,红细胞通常涨大,薛氏点明显,成熟环状体粗大,滋养体有阿米巴样伪足,可见不同发育期的原虫,间日疟（,P.,vivax,）鉴定要点,环状体可呈方形,带状形是特点,成熟滋养体呈菊花状,内含,6,12,个裂殖子,红细胞不涨大，略缩小,有时有西门氏点,三日疟（,P.malariae,）诊断要点,卵形疟（,P.,ovale,）诊断要点,红细胞略涨大或不变大,红细胞边缘呈车轮状,环状体有时呈现鱼眼状,薛氏点明显,成熟滋养体类似三日疟原虫,但更粗大,原虫呈卵圆形,薄血膜中疟原虫寄生时 红细胞的变化,间日疟原虫,三日疟原虫,恶性疟原虫,卵形疟原虫,涨大,色浅淡,略变形,可见薛氏点,(,除早期环状体时,),多重感染少见,疟色素黄褐色,散在,呈小杆状,正常,或略小,正常染色时点彩不明显,多重感染少见,色素见于早期,黑色颗粒状,多见于细胞周围,正常大小,常见多重感染,一些细胞呈黄色边缘较厚,过度染色时茂氏点明显 疟色素颗粒较粗,新月形配子体外红细胞膜见不到,感染红细胞略涨大或不变大,通常呈卵圆形,感染红细胞边缘破碎状,薛氏点明显疟色素棕黄色,类似间日疟原虫,种,周围血中发育阶段,红细胞形态,疟原虫形态,大小,点彩,胞浆,疟色素,裂殖子数,恶性疟原虫,环状体,配子体,正常,常见茂氏点,环状体钎细，常见个核,粗黑，配子体中明显,16-32,间日,疟原虫,各期滋养体,裂殖体和,配子体,涨大,可达正常的,1.5-2,倍,薛氏点可出现,阿米巴样滋养体，浅蓝色，活泼,金棕色,不明显,12,-24,卵形,疟原虫,各期滋养体,裂殖体,涨大,可达正常的,1.25-1.5,倍,薛氏点可出现,卵圆形滋养体，蓝色较深，核较大,深棕色,明显,4-12,三日,疟原虫,各期滋养体,裂殖体和,配子体,正常,西门氏点少见,圆形，蓝色深，核紧缩，滋养体带状,深棕色，粗,明显,6-12,呈菊花状,镜检示教,以下血片采自现症病例,This is a thin film from a 27 year old female backpacker,with a recent history of trekking through Northern Thailand and high fever.,A typical,Plasmodium,falciparum,presentation.,Numerous fine ring forms,Double chromatin dots,Marginal forms,Red cells are not enlarged,A thin film from a 22 year old male holidaying in,Lombok,(Indonesia)one month previously.Intermittent fevers since returning.,A typical,Plasmodium,vivax,presentation,Salient features are:,Developing and thick(signet)ring forms,Enlarged red cells,Recent travel in Africa.Pyrexia of unknown origin.,A typical,Plasmodium,ovale,presentation,Developing form,of plasmodium,Comet-like red,cells,Enlarged red cell,Female patient,arrived from Brazil two weeks previously.Flu like symptoms since arrival.,A typical,Plasmodium,malariae,presentation,Broad band form of,plasmodium,Red cells not,enlarged,This is a thick film prepared from a 32 year old male recently returned from Vietnam.,Numerous ring form of Plasmodium can be seen(as indicated by the arrows).,Note size of,neutrophils,(for comparison).,The only definitive diagnosis that ca