体内药物分析方法及方法的设计与评价

,*,*,体内药物分析,Biopharmaceutical Analysis,体内药物分析方法及方法的设计与评价,生物样本经预处理后，选用适当方法进行测定。可供生物体液中药物及其代谢物含量测定的分析方法很多，归纳起来主要有三类：,（一）光谱分析法,（二）免疫分析法,（三）色谱分析法,除以上三类主要方法外，在生物药物分析中有时还使用同位素标记药物，它们主要应用于,RIA,、同位素逆稀释分析，或作为,GC-MS,分析的内标，以及在药物分离中作示踪应用等。,此外，还有一些含抗生素类药物的生物样品，它们可用微生物方法测定，利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较样品与药物标准品两者对接种的试验菌产生的抑菌圈的大小，借以测定样品内抗生素药物的浓度。,（一）光谱分析法,光谱分析法包括比色测定、紫外分光光度法和荧光分光光度法。光谱法在体内药物分析中是应用较早的方法之一，根据陆明廉对我国,1975,1984,年间血药浓度测定方法的统计，应用光谱法占应用血药分析方法总数的三分之一。虽然近十多年来色谱法的飞速发展，使光谱法退出了体内药物分析应用方法的主角地位，但因其操作简便、快速，在体内药物分析中仍占有一定的地位。,由于光谱法不具备分离功能，选择性较差，因此对样品的预处理要求较高。选用专属的方法或试剂与之反应，测定衍生物的荧光或对光吸收强度，也可借助数学的方法消除干扰。,1,、比色法,比色法灵敏度不高，通常只能测定出,1ug/ml,浓度以上的样品。但该法具有快速，简便，对仪器要求不高等特点。只要采用具有选择性的显色剂和反应条件，可不经分离提取等步骤，直接用于血药浓度监测。,2,、紫外分光光度法,分光光度法的灵敏度较比色法高，适用于测定具有紫外吸收的药物，方法简单，仪器要求也不高。但用于测定含药浓度低的样品时，也受到一定的限制。如测定体液中药物浓度时，亦可能受体液中内源性杂质的干扰和影响。因此，本法在体内药物分析中也受到灵敏度和专一性的限制。但采用一些光谱分析技术，如用差示分光光度法，导数分光光度法，双波长和三波长分光光度法等，可适当提高方法的灵敏度和选择性，也可消除杂质的干扰，因此，该法目前仍用于一些生物样品中的药物检测。,3,、荧光分光光度法,荧光分光光度法的灵敏度比紫外,-,可见分光光度法的灵敏度高，最高可达到,10,-12,g/mL,，虽然有荧光的物质数量不多，但体内许多重要的生化物质、药物及其代谢物或致癌物都有荧光现象。由于荧光衍生物试剂的使用，进一步扩大了荧光分光光度法的应用，因此该法在体内药物分析和药物动力学研究中得到广泛的应用。,（二）免疫分析法,免疫分析主要指放射免疫、酶免疫、荧光免疫分析等。该法的原理是利用抗原,-,抗体特异反应来测定体内药物的含量。该法具有灵敏度高、专一性强、操作简便、快速等优点，是临床治疗药浓监测和生化检验的常用方法，但需要一定的试剂盒和仪器。,(,三,),色谱分析法,色谱方法包括,HPLC,、,GC,和,TLC,等方法。色谱法在我国体内药物分析中的应用始于,20,世纪,80,年代，由于色谱法具有分离分析功能，具有高的专属性和灵敏度，并能同时分离分析结构相似的药物和代谢物等优点，使得其近,20,年来发展迅速，尤其是,HPLC,法，己在体内药物分析领域中确立了主导地位，常用作体内药物分析中评价其他方法的参比方法。近年手性色谱技术、毛细管电泳技术、色谱与光谱联用技术、色谱与免疫联用技术等的建立与发展，更为色谱技术在体内药物分析中的应用增添了无量的前景。,1,、,HPLC,法,HPLC,法在体内药物分析中的应用已大大超过其他分析方法，成为体内药物分析中应用最广泛的技术之一。与,GC,法相比，它具有以下优点：,(1),适用范围广，可在室温下进行检测。对于挥发性低的，热稳定性差的，分子量大的以及离子型化合物等均可测定。,(2),样品预处理简单，可不经萃取和衍生化处理直接测定极性大的水溶性药物，特别适合生物样品的测定；,(3),分离效率高，流动相选择范围广，仪器自动化程度高。,(4),检测器多是针对整分子的光谱特征进行检测的，专一性较高。检测方法多采用非破坏性的。流出组分可回收，可用于样品的制备。,2,、,GC,法,GC,法是最先兴起的具有分离和分析两种功能的测定技术，在药物分析和体内药物分析中曾得到较广泛的应用。由于,HPLC,法的发展，尤其是,RP-HPLC(,反相,-,高效液相色谱法）的广泛应用，使,GC,法的应用相对减少。其原因是,GC,法本身具有一些缺点，应用时常受被测组分的挥发性和热稳定性等方面的限制。用,GC,测定药物时一般需要在,120,以上柱温条件下进行，因此不适合用于遇热不稳定和极性大或挥发性差的药物，不适合用于生物样品的测定。因而影响该法在体内药物分析中的广泛应用。,（四）毛细管电泳法,毛细管电泳法,(CE),，又称高效毛细管电泳法,(HPCE),，是,20,世纪末发展起来的一种高效、快速的分析技术。,HPCE,是以高电压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品各组分之间淌度和分配系数的不同而实现分离的一类液相分离技术。,近年来,HPCE,发展十分迅速，已在化学、生命科学和药学等领域得到广泛的应用。,由于该法具有高效、快速、灵敏、进样少、信息量大、运行成本低、易于自动化等优点。因此使其在体内药物分析及其代谢的检测中得到广泛的应用。,根据,HPCE,法的分离模式的不同。,HPCE,又分为：毛细管区带电泳、胶束电动毛细管色谱、毛细管凝胶电泳、毛细管等电聚焦、毛细管等速电泳和毛细管电色谱法。上述这些方法近几年来在体内药物分析中均得到不同程度应用。,选用何种方法进行体内药物分析为好呢？一般要根据药物的理化性质、结构持征、药物浓度大小、干扰成分的多少、预处理方法、实验目的以及实验室条件等因素综合起来进行考虑。,分析方法的设定依据,(,一,),做好文献总结、整理工作,对已有报道的药物进行测定，应系统总结前人的文献，从中找出哪些问题已解决，还存在哪些问题等。对尚无文献报道的，也可根据药物的性质情况，参考相似类型药物的文献资料。,(,二,),充分了解待测药物的特性与体内状况,药物的理化性质和体内过程是建立方法的主要依据。药物的理化性质包括酸碱性,(pKa),、亲脂性、溶解度、极性、光谱特征、稳定性等，这些性质与分析方法的选择、实验条件的改善密切相关。与常规分析方法不同，体内药物分析的对象是来自生物体内的样品，因此对药物在体内的状况必须了解，如药动学参数、体内代谢情况等。这涉及样品取样频率与间隔，分析方法的选择等。,(,三,),明确测定的目的、要求,应了解拟建立的方法是用于测定药代动力学参数，还是用于临床药浓监测。前者要求具有一定的灵敏度和准确度，不强调简便、快速，设计方法时应考虑到不同时间获得的样品中药物浓度变化较大这一因素。而用于临床药浓监测，则要求方法简便、快速。另外，是否要求同时测定母体药物和代谢物，若需同时测定两者，则应选择具有分离能力或专属的测定方法。,（四）结合实验室条件,根据实验室现有的和可能获得的设备条件加以考虑，选择可行的方法。,方法建立的一般实验步骤,方法初步拟定后，还需进行一系列实验工作，以选择最佳实验条件及验证所拟定的方法是否适合实样检测。通常包括下列步骤：,（一）以纯品进行测定,取药物或其代谢物纯品适量，按拟定方法测定，求得浓度与测定响应值之间的关系，进行线性范围、最适测定浓度、检测灵敏度、测定最适条件,(,如,pH,值、温度、反应时间等）等的选择。,(,二,),空白样品测定,取空白生物样品，按拟定的方法进行处理，测定空白值,(,或色谱图,),。空白值高低或色谱图状况将影响到方法的灵敏度和专属性，应力求将空白值降低。在色谱分析中应力求减少体内样品中内源性杂质峰，对无法消除的内源性杂质峰应设法使其从待测物的色谱区域内移开。能否取得良好的样品空白实验结果，是决定测定方法实际可行性的重要环节，必须设法解决。,(,三,),以水代替空白样品，添加标准后测定,以水代替空白生物样品，添加标准后按拟定的方法进行测定，以了解提取回收率及最低检测浓度的大致情况，从而对萃取溶剂、,pH,值、挥发浓缩等条件进行选择。,(,四,),空白样品中添加标准后测定,于空白生物样品中添加一定量标准品后按拟定方法进行测定，求得样品回收率数据，建立标准曲线。若采用色谱法测定，多数情况下需要用内标法定量，则应首先选择合适的内标，然后进行回收率的测定。,(,五,),体内实际样品测定,经过上述,(,一,),至,(,四,),步骤后进行实际样品的测定。但要指出的是，以上步骤只是生物样品实样检测前的准备工作，不能完全确定是否适用于实样测定。因药物在体内变化是复杂的，如不注意药物代谢和蛋白结合情况，则应用体外建立的方法，进行体内实样测定时往往会失败，甚至导致错误的结论，所以在设计方法时强调对药物体内过程要有一定程度的了解，从而选择避免干扰和适合样品实际情况的方法。有时也可采用专属性强，已证明用于体内实样测定的步骤和方法作为对照测定，以此来检验所建立的方法的实际可行性。,方法的评价,对于所建立的体内药物分析方法的可行性与可靠性，需要应用若干标准来进行方法学的考察与评价。这是研究和建立一个新的分析方法时必须着重抓住的几个环节。,评价一个体内药物分析方法的优劣主要有以下几个指标：精密度、准确度、灵敏度、专属性或选择性、可测浓度范围、测定所需时间以及对生物样品的适应性等，现择要讨论如下：,（一）准确度,准确度,(accuracy),是方法评价的最基本要点之一，它是表示测定结果与真值的符合程度。常用回收率,(recovery),数值反映测定的准确程度，也可通过与其他已建立的方法进行比较的办法来加以反映。,将已知量的药物纯品加到空白样品,(,如血样,),中去，经过一系列的处理、测定，所得药物量与加入量之比值的百分率即为回收率。,回收率当然越接近,100,越好，但因样品组分复杂，含量低，处理步骤多时就很难达到高的回收率。对于一个方法来说，更为重要的是每次测定所得回收率要保持恒定，虽然有时回收率较低，但只要重现性好，通过校正后仍可采用。根据回收率测定方法不同可分为绝对回收率和方法回收率。,1,绝对回收率,绝对回收率也称萃取回收率、提取回收率，它反映了一个方法的萃取效率，与体内样品检测灵敏度有关，是评价体内药物分析方法的重要指标之一。,现以色谱法为例，说明绝对回收率的求算过程。,例如取一定量被测药物标准品，加到空白血样中，按规定方法处理，使最后溶液中药物标准品浓度为,1ug/mL,，测定色谱峰面积，记为,A,测,，另取,1ug/mL,的药物标准品的纯溶剂溶液宜接进样，测得色谱峰面积记为,A,真,，用外标法计算。,绝对回收率应考察高、中、低,3,个浓度，低浓度选择在定量限,(LOQ),附近，高浓度在标准曲线的上限附近，中间选一个浓度。对于回收率的大小与变异不宜苛求，一般添加量在,10,-6,10,-9,级，绝对回收率若能达到,50,80,，应认为是令人满意的。,在色谱分析中常采用内标法测定含量，将药物标准品和内标准物质加到空白血样中，按规定方法处理，测得药物和内标峰面积，求出它们的比值,R,测,A,药,/A,内,。另取相同浓度的药物标准品和内标准物质的纯溶剂溶液进样，得药物标准品和内标峰面积，计算两者的比值,R,真,A,药,/A,内,。再根据下式求出回收率：,在内标法中，应注意药物与内标准物质各自用外标法测得的绝对回收率应相近，两者相差应小于,10,，否则回收率偏离,100,太远。,2,方法回收率,取一系列浓度的药物标准品加到空白体液中，按设定方法测定，根据标准品浓度及响应的测定信号值绘制标准曲线，先按最小二乘法求出回归方程。然后取高、中、低浓度的药物标准品添加到空白体液中，每个浓度至少平行测定,5,份，按标准曲线制备方法同法测定，所得信号值代入回归方程，求得测定值。最后与加入量比较，得方法回收率。除定量限外，各浓度点测得的平均值偏离实际加入量应小于,15,，定量限这一点应小于,20,。,在测定回收率时，不管采用何种方法，都要注意以下几个问