荧光直接监测用于肺癌治疗前药物的靶向递送和诊断ppt课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,荧光,直接监测用于肺癌治疗前药物的靶向递送和,诊断,中国科学院,烟台海岸带研究所筹建于,2006,年,，成立,于,2009,年。,2017,年,中科院党组宣布青岛海洋研究所,与烟台海岸带所融合发展。海岸带,所将是,中国专门从事,海岸带综合研究,的唯一国立研究机构，位于美丽的海滨城市,山东省烟台市,。,研究所全貌,研究所,位置,“,一所一船两,站”,“创新一”科学考察船,精致,欧式,小木屋办公楼,黄河三角洲滨海湿地生态站,牟平海岸带环境综合试验站,生物,观测,样地,研究所实验楼,研究领域：环境与健康,成像分析技术,：,是一种研究与生命相关物种的无损成像分析技术，通过多模态成像分析，探索,环境污染,物如何作用于生物体，以揭示生态环境变化与人类健康关系。,一 肿瘤荧光诊疗试剂,灵敏早期,诊断,特异性靶向治疗,高效实时监控治疗效果,非小细胞肺癌（,NSCLC,）是一种恶性程度高、预后效果差的呼吸系统,肿瘤,。,1,：,全身性,用药是治疗中晚期,NSCLC,的主要手段,抗肿瘤药,物靶向性差，病人会产生不良反应如食欲不振、脱发、骨髓抑制和肝肾功能损伤,药物浓度低诱导肿瘤细胞产生耐药情况,通过,将药物设计成前药，并增加病灶的靶向配体，最终根据疾病选出特定的内环境使药物在疾病部位释放，从而增强药物的选择性和效率的新手段。,研究背景,2,：药物,的靶向投递系统,减少病人的不良反应,能增加药物局部浓度，减少耐药状况的出现,研究背景,肿瘤,的,靶,向,前药,靶向配体,肿瘤环境打断的化学键,修饰的前药,检测缺氧的导致的硝基还原酶的,硝基（,-NO,2,）,检测,过氧化氢的硼酸,酯,检测,谷胱,甘（,GSH,）的二硫键,(-S-S-),前列腺特异表面抗原（,PSMA,）,叶酸,受体,唾液酸,可被修饰的抗癌药物,荧光成像,治疗诊断试剂（,theranostics,）,将荧光团标记于药物可以在不影响药物代谢动力学基础上，利用荧光信号的变化来对药物的代谢状况进行实时,监测,。,荧光标记,药物不仅能够显示药物的代谢状况，同时能明确药物的靶向性,。,研究内容,聚,胺类似物（,PA,）,-,吉非替尼（,PPG,）,1.,设计了两个靶向前药：,生物素,-,吉非替,尼,(PBG),吉非替尼是一种表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂（,EGFR-TKIs,），用于治疗有,EGFR,突变的,NSCLC,。,但是吉非替尼在临床中遇到耐药的问题，尤其是继发性耐药，多是由于在吉非替,尼治疗浓度,下诱导而发的,。,二硫键是一种可以被自由硫醇打断的化学键，,在,肿瘤,细胞中,，谷胱甘肽的,浓度,比,正常,的,细胞中高。谷胱甘肽,是打断这种化学键的理想的物质,。,利用二硫键来设计抗肿瘤药物的释放和荧光团的共轭结构的改变,。,聚胺转运系统（,PUS,）在,II,型肺泡上皮细胞上的相对高表达,肿瘤,表面的过表达的营养受体,-,生物素,1.1,靶向前药的设计：,1.2,靶向前药的释放：,谷胱甘肽和前药反应释放吉非替尼的,反应机理：,高效液相色谱检测前药对于谷胱甘肽的响应：,直到反应后的第,17,个小时，吉非替尼完全释放,研究内容,2.,设计了两个,小分子治疗诊断试剂：,2.1,治疗诊断试剂的设计：,聚,胺,类似物,-,吉非替尼治疗诊断试剂（,TPG,）,生物素,-,吉非替,尼,治疗诊断试剂,(TBG),2.2,谷胱甘肽和前药反应释放吉非替尼和近红外荧光团的反应机理,2.3 TPG,和,TBG,在细胞中可以缓释药物，这种缓释作用是由生物硫醇介导的,1 h,:,可以检测到的荧光,信号,吉,非替,尼,开始,释放,16 h,:,荧光信号达到,最强,，吉,非替尼完全,释放,39 h,:,荧光信号消失，,吉非替尼完全释放,长程、缓释,2.4,TPG,和,PBG,通过受体介导的跨膜转运方式进入细胞的研究,1,）预处理,5 M PA,或者生物素,2,）,细胞,在,4C,条件下培养,1,小时,细胞表面的,聚胺转运受体和生物素转运受体,被完全占据，荧光诊疗试剂不能进入细胞,当中,。,低温处理过的细胞，由于,ATP,的代谢被抑制，只有少部分的荧光诊疗试剂缓慢跨膜，说明,能量,是一种能够促进荧光诊疗试剂进入细胞的,因素,.,2.5 TPG,可以诱导,PC9,和,H1650,细胞的凋亡，而,TBG,只能诱导,PC9,细胞的凋亡,1)PC9,细胞和,H1650,细胞凋亡过程的荧光成像,2,）,断裂的,caspase,3,在,PC9,细胞和,H1650,细胞中的表达水平,生物素靶,向的前药和诊断试剂,不能,引起其,c-caspase 3,激活，没有,c-caspase 3,依赖的凋亡,出现,。,聚胺类似物靶向的前药和诊断试剂,可以,诱导该细胞产生凋亡,。,聚,胺类似物,修饰,的前药比生物素修饰的前药有更强的致凋亡,能力,。,荧光团,的修饰并没有,改变,前药,的,治疗效果。,H1650,细胞耐药,细胞系,：,PC9,细胞作为对吉非替尼敏感的细胞系，对于改造后的靶向前药依然,敏感。,3,）,PC9,细胞和,H1650,细胞的细胞凋亡,情况,2.6 PA,选择性的抑制肿瘤细胞，源于肺泡上皮细胞聚胺转运系统的高表达,鸟氨酸脱羧酶（,ODC,）,作为聚胺转运系统代谢的一种关键的酶，相比较于间质来源的,IMR-90,细胞，在肺泡上皮细胞来源的两种细胞,PC9,细胞和,H1650,细胞中高表达。,IMR-90,（人胚肺成纤维细胞,）,在,测试的,PA,浓度下细胞存活率维持在,90%,以上，并且与浓度没有明显,相关性。,H1650,（,肿瘤细胞,）,，,细胞存活率随着,PA,处理浓度的增加，细胞存活率也在,下降。,印证了我们利用靶向聚胺转运系统设计靶向前药的,想法,2.7 PA,能抑制,H1650,细胞,Akt,通路活化,1,）流式细胞仪分析,p-Akt,表达,2,）蛋白印迹法,分析,p-Akt(Ser 473),和总,Akt,的表达水平,H1650,细胞对,吉非替尼耐药的,原因,：,失,调控的,Akt,通路的,活化,。,流式细胞仪,的结果与,Western Blot,结果一致，,EGF,能成功刺激,p-Akt,高表达，而在,PA,预处理的细胞样本中,，,PA,能够抑制,AKT,活化,，且,EGF,并没有,引起,p-Akt,的高表达，并且对于,p-Akt,的抑制与浓度相关,。,2.8 p-EGFR,和,p-Akt,在,PC9,细胞和,H1650,细胞中的表达水平,对于,吉非替尼敏感株,PC9,细胞，四种前药都能比吉非替尼更强地抑制,EGFR,的磷酸化，这源于,靶向配体,增加了局部的药物浓度，增强了治疗,效率。,TPG,和,PPG,对于,H1650,产生比同样浓度下的吉非替尼更好的促凋亡作用源于,PA,对于,p-Akt,的抑制而产生的协同治疗作用,。,PA,修饰的靶向前药不仅能增强对于,NSCLC,细胞的选择性，还能通过增强对于,Akt,通路的抑制来增加治疗效果。,2.9 TPG,、,PPG,、,TBG,和,PBG,均能抑制,PC9,肿瘤，,TPG,和,PPG,能够抑制,H1650,肿瘤的生长,a.,肿瘤荧光,图像,b,）,肿瘤,体积,c,）,肿瘤,质量,d,）,小,鼠质量,e,）,Ki67,表达,2.10 TPG,和,TBG,在,活体内,对,H1650,肿瘤,均具有较好的选择性,TPG,虽然在体内有各器官蓄积的情况出现，但是并没有释放治疗,药物,.,TPG,会在,8,小时后富集于肿瘤并,释放,.,TBG,在,注射后,8,小时就会富集于肿瘤，而且会在其他非靶向器官中释放部分药物，因此在一定程度上会降低前药对于肿瘤的疗效。,2.11TPG,能够准确筛选出,NCSLC,组织，并且比,CEA,和,CK-19,联合诊断的敏感性更高,纤支镜经支气管肺活组织检查（,TBLB,）所取得的标本进行检测,。,利用免疫荧光,的手段，标记癌胚抗原（,CEA,）和角蛋白,19,片段（,CK-19,），与,TPG,结果一起对比病理结果，来观察,TPG,在快速诊断中的可行性和,准确性,。,TPG,与两种,NSCLC,标记物有相同的诊断特异度，都能选出,NSCLC,组织。,TPG,有比两种,NSCLC,标记物更高的敏感度,，,TPG,能选出所有非,NSCLC,组织，两种,NSCLC,标记物未选出,4,例,NSCLC,组织。,二、小分子荧光探针,可视化,研究,无需,试样,预处理,非,侵入式,检测,灵敏度高,选择性好,响应时间短,实时动态监控,Xiaoyue Han,Fabiao Yu,Xinyu Song and Lingxin Chen*,Chemical Science,2016,7,5098-5107,.,一、,近红外,比率型荧光探针定量,检测多硫化半胱氨酸含量,1,）探针结构及其对多硫化半胱氨酸的响应机理,ex,=,730,nm,ex,=614 nm,F,749 nm/F797 nm,=0.0378 Cys-SSH M-0.0098,r=0.9913,，用于定量分析,激光共聚焦成像,流式细胞仪定量,质谱衍生法进一步验证,1.89 0.2 M,0.82 0.3 M,2.51 0.4 M,2,）探针用于定量检测细胞内源性多硫化半胱氨酸含量,激光共聚焦成像,流式细胞仪定量,3,）探针用于定量检测正常肝细胞中内源性多硫化半胱氨酸的浓度变化,4,）探针用于靶,向,检测原位肝癌,大鼠,中肝脏的多硫化半胱氨酸浓度,近红外探针具有组织穿透性,比率探针用于定量，消除探针分布不均可能造成的影响,探针具有肝定位功能,肝癌小鼠中,多,硫化半胱氨酸浓度低于正常小鼠，多硫化物浓度可能与癌症的发生，发展及治疗有关,二、,近红外,比率型荧光探针定量检测急性肝炎爆发下细胞和活体中的硒醇浓度,1,）,探针,的设计和响应机理,Xiaoyue,Han,Xinyu Song,FabiaoYu,*Lingxin Chen*,，,Advanced,Functional,Materials,，,2017,，,Accepted.,lg(F,750 nm,/F,800 nm,)=0.08975 Sec(M)-0.7085,r=0.9912.,2,）,探针定量检测,HepG2,，,HL-7702,以及原代小鼠肝细胞中,硒醇,的浓度,4.34,0.30 M,3.08 0.11 M,4.03 0.16 M,3,）,探针定量,检测,肝细胞急性和慢性炎症爆发过程,中,硒醇,的浓度,Group d:,慢性炎症,+INF-,Group c:,硒,代,胱氨酸,+,IL-1,Group b:,急性炎症,IL-1,Group,e:,硒代胱氨酸,+INF-,细胞凋亡和坏死,NF-B,免疫荧光,急性炎症比慢性炎症引起的硒醇浓度降低更多,硒,醇的降低会引起细胞的凋亡和坏死,硒,醇的降低会引起,NF-B,的表达,硒,醇能保护细胞免收炎症损伤,4,）,探针检测,CCl,4,诱发的急性肝炎发过程,中,硒醇,的,保护,作用,Group,a:,生理盐水,Group,b:,探针,Group,c:,CCl,4,6 h,Group,d:,CCl,4,24 h,Group,e:,selenocystine,(i.p,.)+,CCl,4,6 h,Group,f:,selenocystine,(i.p,.)+,CCl,4,24,h,h),原代细胞,I),丙,二,醛,j),8-,羟基,-2-,脱氧鸟苷,k),丙氨酸氨基转移酶,l,),天冬氨酸,转氨酶,m)NF-B,n),IL-6,o),细胞凋亡和坏死,p),p-,JNK,表达,硒,醇在,CCl,4,刺激,6,h,内浓度升高，,24h,后降低。表明机体自我保护，使得硒醇浓度升高。,硒,醇有抗炎症和抗氧化作用。,三、对超氧阴离子和多硫化氢的多,响应近红外荧