教育精品：12基因工程的基本操作程序

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,1.2,基因工程的基本操作程序,1,、目的基因的获取,2,、基因表达载体的构建,3,、将目的基因导入受体细胞,4,、目的基因的检测与鉴定,基因工程基本操作的四个步骤,详细过程,一、目的基因的获取,（,指编码蛋白质的基因,）,目的基因,供体,DNA,DNA,片段,信使,RNA,目的基因,逆转录合成,肽链氨基酸序列,信使,RNA,序列,基因,DNA,序列,目的基因,合成,推测,直接提取法,（已有的物种分离）,人工合成法,逆转录法,化学合成法,cDNA,合成,1,、,从基因文库中提取目的基因,基因文库概念,又称,DNA,文库，将含有某种生物不同基因的许多,DNA,片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称基因文库。,基因文库由,外源,DNA,片段、载体和宿主组成。,基因文库,中不是直接保管相应基因，而是,保存受体菌,，受体菌中含基因,P9,寻根问底,:,有了基因文库，就可随时从中提取所需要的目的基因引入受体细胞使之表达。,PCR,基因组文库,部分基因文库,基因组文库和部分基因文库,(,cDNA,文库,),比较,2,、利用,PCR,提取目的基因,PCR,：是一项在生物,体外复制特定,DNA,片段,的核酸合成技术。,模板,DNA,；,DNA,引物；四种脱氧核苷酸；,热稳定,DNA,聚合酶（,Taq,酶）,利用,DNA,双链复制的原理，将基因的核苷酸序列不断地加以复制，使其数量呈指数方式增加。,即,2,n,（,n,为扩增循环的次数）,1,、概念：,2,、原料：,3,、,PCR,的基本原理,前提,:,已知目的基因的脱氧核苷酸序列,方法：,DNA,受热变性解旋为单链、冷却后,DNA,引物与单链相应互补序列结合、,DNA,聚合酶作用下延伸合成互补链,。,指数增长,归纳,1,2,3,4,5,22,55,72,94,时间（,min,）,温度,（）,PCR,反应,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,适温延伸,3,高温变性,1,低温退火,2,重复,13,步,2530,轮,目的,DNA,片段,扩增,100,万倍以上,DNA,双螺旋,DNA,单链,与引物结合,DNA,变性,形成,2,条单链,子链延伸,DNA,加倍,从基因文库中获取,利用,PCR,技术扩增,利用化学方法人工合成,归纳：获取目的基因的方法,2,构建载体,二、基因表达载体的构建,组成,目的基因,启动子,终止子,标记基因,使目的基因在受体细胞中,稳定存在,；可以,遗传,给下一代；使目的基因能够,表达,和发挥作用。,目的：,非编码区,非编码区,编码区,RNA,聚合酶结合位点,外显子,内含子,终止子,基因的结构,启动子,原核,真核,不能编码蛋白质调控遗传信息,能编码蛋白质,编码蛋白质的序列,不编码蛋白质的序列,真核细胞基因结构的主要特点是,:,编码区是间隔的、不连续的。,位于基因的首端，是,RNA,聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出,mRNA,。,位于基因的尾端，相当于一盏红色信号灯，使转录停止，。,启动子：,终止子：,用与提取目的基因相同的限制酶切割质粒使之出现一个切口，将目的基因插入切口处，让目的基因的黏性末端与切口上的黏性末端互补配对后，在,DNA,连接酶的作用下连接形成重组,DNA,分子。,目的基因与运载体结合,步骤,获取目的基因,载体,与,表达载体,的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分,DNA,片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构,用到的工具酶：,既用到限制酶切割载体，又用到,DNA,连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键,启动子、终止子,对于目的基因表达必不可少,目的基因不能单独进入受体细胞，,必需以表达载体的方式携带进去。,注意,1,、将目的基因导入植物细胞的方法：,（,1,）,农杆菌转化法,农杆菌特点：,易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力,农杆菌中的,Ti,质粒上的,T-DNA,可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的,DNA,上。,三、将目的基因导入受体细胞,原理：,过程,补充归纳导入方法,（表达载体导入农杆菌，再让农杆菌感染植物细胞）,1,、将目的基因导入植物细胞,1,、将目的基因导入植物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,导入动物,2,、将目的基因导入动物细胞,方法：显微注射法,程序：,目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）显微注射 受精卵 新性状动物,3,、将目的基因导入微生物细胞,原核生物特点：,繁殖快、单细胞、遗传物质少,方法：,用,Ca,2+,处理细胞 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收,DNA,分子,四、目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,（一）、检测,1,、检测转基因生物染色体的,DNA,上是否插入了目的基因,(,关键步骤,),.,首先取出转基因生物的,基因组,DNA,.,用含目的基因的,DNA,片段用放射性同位素等作标记,以此做探针,.,使探针和转基因生物的,基因组,DNA,杂交,若显示出杂交带,表明目的基因已插入染色体,DNA,中,（,1,）,方法,:,DNA,分子杂交,（,2,）过程,:,DNA,分子杂交示意图,采用一定的技术手段，将两种生物的,DNA,分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。,P,15,思考与探究,（二）、鉴定（个体生物学水平）,2,、检测目的基因是否转录出了,mRNA,3,、检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法,:,分 子 杂 交,方法,:,抗原抗体杂交,用上述探针和转基因生物的,mRNA,杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了,mRNA,过程,四、目的基因的检测与鉴定,检测,:,是否插入目的基因（,DNA,分子杂交,技术）,是否转录（,分子杂交,技术）,是否翻译（,抗原一抗体,杂交,）,鉴定,:,功能活性鉴定,抗性鉴定,归纳步骤,归纳,:,基因工程的基本操作程序,目的基因的获取,从基因文库中获取,利用,PCR,技术扩增,利用化学方法人工合成,基因表达载体的构建,目的基因、启动子、终止子、标记基因,将目的基因导入受体细胞,农杆菌转化法、显微注射法、,Ca,离子转化法,目的基因的检测与鉴定,检测：是否插入、转录、翻译,鉴定,:,功能活性鉴定,抗性鉴定,练习,1,：,(2008,理综山东卷,),为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。,（,1,）获得耐盐基因后，构建重组,DNA,分子所用的限制性内切酶作用于图中的,处，,DNA,连接酶作用于,处。（填“,a”,或“,b”,）,a,a,练习,1,：,(2008,理综山东卷,),为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。,（,2,）将重组,DNA,分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和,法。,（,3,）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用,技术，,（,4,）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的,作探针进行分子杂交检测，又要用,方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。,基因枪法（花粉管通道法）,植物组织培养,耐盐基因,一定浓度盐水浇灌水稻,思考与探究,3,、,有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基体复合体上加工完成的，内质网和高尔基体复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器。因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的,4,、从小鼠中克隆出,-,珠蛋白基因的编码序列在编码序列前接上在大肠杆菌中可以适用的,启动子,，另外加上,抗四环素的基因,，构建成一个表达载体。将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明,-,珠蛋白基因已进入其中。培养进入了,-,珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取,-,珠蛋白,