资源描述
单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,多聚酶,链,链式反,应,应扩增,DNA,片断,一、基,础,础知识,（一）,DNA,分子的,结,结构,C,、,H,、,O,、,N,、,P,1,、组成,元,元素,脱氧核,苷,苷酸,2,、基本,单,单位,3,、脱氧,核,核苷酸,结,结构,脱氧核苷酸,脱氧核苷,磷酸,脱氧核糖,含氮碱基,嘌呤,嘧啶,腺嘌呤（,A,）,鸟嘌呤（,G,）,胞嘧啶（,C,）,胸腺嘧啶（,T,）,一个核,苷,苷酸上,的,的磷酸基,团,团上的,“,“,OH”,和另一个,核,核苷酸,分,分子的,第,第三位,碳,碳原子,上,上的羟,基,基之间失,去,去一分,子,子水，,形,形成磷酸二,脂,脂键，即在相邻的两个脱,氧,氧核苷,酸,酸的,3,和,5,碳原子之间形,成,成磷酸,二,二脂键,。,。数量,庞,庞大的,四,四种脱,氧,氧核苷,酸,酸通过,3,、,5,、磷酸,二,二脂键,彼,彼此连,接,接起来,形,形成脱,氧,氧核苷,酸,酸链。通常将,DNA,的羟基,“,“,OH”,末端称,为,为,3,端，而,磷,磷酸基,团,团的末,端,端称为,5,端,4,、多脱,氧,氧核苷,酸,酸链得,形,形成,碱基,OH,O,O,P,O,HO,OH,O,O,P,O,HO,碱基,OH,OH,O,O,P,O,HO,碱基,O,OH,O,O,P,O,HO,OH,碱基,5,3,3,5,碱基,脱氧核糖,磷酸基团,碱基,脱氧核糖,碱基,脱氧核糖,5,3,多脱氧,核,核苷酸,链,链结构,简,简图,5,5,3,3,6,、利用,碱,碱基互,补,补配对,规,规律的,计,计算,规律一,：,：,DNA,双链中,的,的两条,互,互补链,的,的碱基,相,相等，,任,任意两,个,个互补,的,的碱基,之,之和相,等,等即,A=T,，,G=C,。任意,两,两个不,互,互补的,碱,碱基之,和,和恒等,，,，占碱,基,基总数,的,的,50%,。即：,A+G,T+C,A+C,T+G,50%,，（,A+G,）,/(T+C),(A+C)/(G+T),(T+C)/(A+G),1,规律二,：,：在,DNA,双链中,的,的一条,单,单链,(A+G)/(T+C),的值与,另,另一条,互,互补链,的,的,(A+G)/(T+C),的值互,为,为倒数,关,关系,规律三,：,：,DNA,双链中,，,，一条,单,单链的,(A+T)/(G+C),的值与,另,另一条,互,互补链,的,的,(A+T)/(G+C),的值是,相,相等的,，,，也与,整,整个,DNA,分子中,的,的,(A+T)/(G+C),的值相,等,等,（二）,DNA,分子的,特,特性,1,、稳定,性,性,在,DNA,分子双,螺,螺旋结,构,构的内,侧,侧，通过氢键形成的,碱,碱基对,，,，使两,条,条脱氧,核,核苷酸,长,长链稳,固,固的并,联,联起来,例题：,甲,甲,DNA,分子中,，,，,A,和,T,占,25,，,G,和,C,占,75%,，乙,DNA,分子中,，,，,G,和,C,占,25,，,A,和,T,占,75%,，哪一,个,个稳定,？,？,答：甲,DNA,分子比,乙,乙,DNA,分子稳,定,定。因,为,为,A,与,T,之间形,成,成两个,氢,氢键，在,G,和,C,之间形,成,成三个,氢,氢键，三个氢,键,键比两,个,个氢键,稳,稳定，,所,所以在,DNA,分子中,含,含有较,多,多的,G,C,碱基对,比,比含有,较,较多的,A,T,碱基稳,定,定,2,、多样,性,性,构成,DNA,分子的,碱,碱基对,的,的数量,不,不同，,碱,碱基对,的,的排列,顺,顺序千,变,变万化,例题：,如,如果有,4000,个碱基,对,对，碱,基,基对有,多,多少种,排,排列方,式,式？,答：碱,基,基对排,列,列方式,有,有,4,4000,种,3,、特异,性,性,不同的,DNA,分子由,于,于碱基,对,对的排,列,列顺序,存,存在差,异,异，因,此,此每一,个,个,DNA,分子的,碱,碱基对,都,都有其,特,特定的,排,排列顺,序,序，这,种,种特定,的,的排列,顺,顺序包,含,含着特,定,定的遗,传,传信息,，,，每一,种,种生物,(A+T)/(G+C),的比值,是,是特定,的,的,（三）,DNA,的复制,2,、时期,有丝分,裂,裂间期,减,减数第,一,一次分,裂,裂前的,间,间期,3,、场所,细胞核,（,（主）,、,、线粒,体,体、叶,绿,绿体,4,、模板,DNA,母链,1,、概念,由一个,DNA,形成两,个,个完全,相,相同的,DNA,的过程,5,、原材,料,料,脱氧核,苷,苷酸,6,、基本,条,条件,酶、,ATP,、原料,、,、模板,7,、复制,过,过程,DNA,的解旋,亲代,DNA,分子利,用,用细胞,提,提供的,能,能量在,解,解旋酶,的,的作用,下,下氢键,断,断裂，,部,部分双,螺,螺旋链,解,解旋为,两,两条平,行,行的双,链,链,RNA,引物的,合,合成,以单股,DNA,为模板,，,，在引,物,物酶的,作,作用下,合,合成小,段,段的,RNA,引物,DNA,的生成,以单股,的,的,DNA,为模板,，,，在,DNA,聚合酶,的,的作用,下,下，在,RNA,引物的,末,末端由,5,端,3,端合成,DNA,。,切掉引,物,物生成,冈,冈崎片,断,断,在核酸,酶,酶的作,用,用下切,掉,掉引物,。,。在,DNA,聚合酶,的,的作用,下,下将引,物,物部位,换,换上,DNA,，此时,的,的,DNA,片断称,为,为冈崎,片,片断,DNA,片断的,连,连接,在,DNA,连接酶,的,的作用,下,下将冈,崎,崎片断,连,连接起,来,来。形,成,成一条,完,完整的,新,新的,DNA,链。新,链,链与旧,链,链构成,新,新的,DNA,边解旋,边,边复制,(,过程）,8,、复制,特,特点,半保留,复,复制（,结,结果）,9,、遵循,原,原则,碱基互,补,补配对,原,原则,10,、精确,复,复制的,原,原因,11,、复制,的,的意义,DNA,分子通,过,过复制,使,使遗传,信,信息从,亲,亲代传,给,给了后,代,代，从,而,而保持,了,了遗传,信,信息的,连,连续性,规则的,双,双螺旋,结,结构为,复,复制提,供,供了精,确,确的模,板,板,碱基互,补,补配对,能,能力保,证,证了复,制,制准确,无,无误的,进,进行,一条双,链,链,DNA,分子，,复,复制,N,次，形,成,成的子,代,代,DNA,分子中,，,，含亲,代,代,DNA,母链的,有,有两个,DNA,分子，,占,占子代,DNA,总数的,2/2,N,；亲代,DNA,分子母,链,链两条,，,，占子,代,代,DNA,中脱氧,核,核苷酸,链,链总数,的,的,2/2,N+1,=1/2,N,设一条,DNA,分子中,有,有胸腺,嘧,嘧啶为,m,个，则,该,该,DNA,复制,n,次后，,形,形成子,代,代,DNA,分子需,游,游离的,胸,胸腺嘧,啶,啶为,T=(2,N,-1)m,12,、,DNA,复制过,程,程中的,等,等量关,系,系,（四）,PCR(,多聚酶,链,链式反,应,应）,1,、,DNA,聚合酶特性,不能从头,合,合成,DNA,，只能从,DNA,的,3,端开始延,伸,伸,DNA,链，因此,，,，,DNA,复制需要,引,引物,2,、,DNA,聚合酶作用过程,当引物与,DNA,母链通过,碱,碱基互补,配,配对结合,后,后，,DNA,聚合酶就,能,能从引物,的,的,3,端开始延,伸,伸,DNA,链，,DNA,的合成方,向,向总是从,子,子链的,5,端向,3,端延伸,3,、,PCR,原理,在,80,100C,的温度范,围,围内，,DNA,的双螺旋,结,结构将解,体,体，双链,分,分开，这,个,个过程称,为,为变性,当温度缓,慢,慢降低后,，,，两条彼,此,此分离的,DNA,链又会重,新,新结合成,双,双链,PCR,利用了,DNA,的热变性,原,原理，通,过,过控制温,度,度来控制,双,双链的解,聚,聚与结合,，,，现在使,用,用的,PCR,仪实质上,也,也是一台,能,能够自动,调,调控温度,的,的仪器,高温解决,了,了打开双,链,链的问题,，,，但是，,又,又导致,DNA,聚合酶失,活,活的问题,，,，耐高温,的,的,TaqDNA,聚合酶解,决,决了高温,导,导致,DNA,聚合酶失,活,活的问题,，,，促成了,PCR,技术的自,动,动化,4,、,TaqDNA,聚合酶的,应,应用,5,、缓冲,液,液需要为,PCR,反应提供,的,的物质,DNA,模板，分,别,别与两条,模,模板链相,结,结合的两,种,种引物，,四,四种脱氧,核,核苷酸，,耐,耐热的,DNA,聚合酶，,同,同时通过,控,控制温度,使,使,DNA,复制在体,外,外反复进,行,行,PCR,技术是,80,年代中期,发,发展起来,的,的体外核,酸,酸扩增技,术,术。它,具,具有特异,、,、敏感、,产,产率高、,快,快速、,简,简便、,重,重复性好,、,、易自动,化,化等突出,6,、,PCR,技术的特,点,点,7,、细胞内和,细,细胞外,DNA,复制环境,的,的区别,PCR,过程需要,的,的引物不,是,是,RNA,，而是人,工,工合成的,DNA,单链，其,长,长度通常,为,为,20,30,个脱氧核,苷,苷酸,8,、细胞内,复,复制和,PCR,不同点,PCR,过程中,DNA,的解旋不,依,依靠解旋,酶,酶，而是,通,通过对反,应,应温度的,控,控制来实,现,现的,（五）,PCR,的反应过,程,程,1,、,PCR,的反应步,骤,骤,PCR,一般经历,三,三十多次,循,循环，每次循环,可,可以分为,三,三个基本,步,步骤,变性、复,性,性和延伸,变性（模,板,板,DNA,解旋）,模板,DNA,经加热至,90,0,C,以上。一,定,定时间后,，,，使模板,DNA,双链或经,PCR,扩增形成,的,的双链,DNA,解离，使,成,成为单链,，,，以便于,它,它与引物,结,结合，为,下,下轮反应,作,作准备,2,、循环过,程,程,靶序列,靶序列,PCR,循环第一步：加热变性,复性（退,火,火）,模板,DNA,经加热变,性,性成单链,后,后，温度,降,降到,50,0,C,左右，引,物,物与模板,DNA,单链的互,补,补序列配,对,对结合,靶序列,靶序列,引物,引物,5,3,5,5,3,5,3,3,PCR,循环第二步：引物与靶序列退火,延伸,DNA,模板引,物,物结合物,在,在,TaqDNA,聚合酶的,作,作用下以,脱,脱氧核苷,酸,酸为原料,，,，以母链,为,为模板，,按,按碱基互,补,补配对的,原,原则与半,保,保留复制,的,的原理，,合,合成一条,新,新的,DNA,链,靶序列,靶序列,引物,引物,5,3,5,5,3,5,3,3,Taq DNA,聚合酶,PCR,循环第三步：引物延伸,靶序列,靶序列,第,1,个,PCR,循环完成后：得到两个拷贝的靶序列,3,、,30,次循环后,靶,靶序列扩,增,增的数量,4,、,PCR,循环的结,果,果,DNA,聚合酶只,能,能特异性,地,地复制处,于,于两个引,物,物之间的,DNA,序列，使,这,这段固定,长,长度的序,列,列呈指数,扩,扩增,从第二轮,循,循环开始,，,，上一次,循,循环的产,物,物也作为,模,模板参与,反,反应，并,且,且由引物,延伸而成,的,的,DNA,单链会与,引,引物,结合，进,行,行,DNA,的延伸,二、,PCR,的实验操,作,作,1,、,PCR,仪,（一）设,备,备及用具,实质上一,台,台能够自动调控,温,温度的仪器,2,、微量离,心,心管,一种薄壁塑料,管,管，总容积,为,为,0.5ml,3,、微量移,液,液器,用于定量转移,PCR,配方中的液体，其上的一,次,次性吸液,枪,枪头用一,次,次更换一,次,次,PCR,仪,微量离心管,微量移液器,PCR,技术高度灵敏,，,，为了避免,外,外源,DNA,等因素的,污,污染而造,成,成干扰实,验,验，,PCR,操作时要,注
展开阅读全文