碱裂解法提取质粒

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,碱裂解法提取质粒DNA,通过质粒的一些特性、质粒,DNA,的提取、测定，学习用碱变性法提取质粒,DNA,的方法，掌握碱裂解法提取质粒,DNA,的原理及操作。,一、实验目的,质粒,(,Plasmid,),：,质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链,DNA,分子，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋形式存在。存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。,二、实验原理,质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，具有以下特点：,易于鉴定；,在受体细胞中可以独立复制；,易于筛选；,易于导入受体细胞。,二、实验原理,高碱,细菌的细胞壁破裂，内容物释放,染色体,DNA,断裂成不同长度的线性双链,DNA,；,线性双链,DNA,片段中的氢键断裂，双链解离变性。,质粒,DNA,不发生断裂，保持双链闭合环状；,双链,DNA,并不完全分离。,高酸中和至中性,变性的染色体,DNA,与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚成网络状大分子不溶性沉淀物,质粒,DNA,又恢复天然构型，溶解在上清液中,纯化,RNA,酶消化除去,RNA,，并用酚抽提法除去残留的蛋白质,SDS,是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以,SDS,处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒,DNA,以及基因组,DNA,从细胞中同时释放出来。释放出来的,DNA,遇到强碱性,(NaOH),环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒,DNA,将迅速复性，而基因组,DNA,，由于分子巨大，难以复性。离心后，质粒,DNA,将在上清中，而基因组,DNA,则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒,DNA,从细菌中提取出来。,三、主要试剂及作用,溶液,：由葡萄糖、,EDTA,、,Tris-HCl,组成,(,保护、缓冲,),葡萄糖,的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的 机械剪切作用,防止破坏质粒,(,保护作用,),EDTA,的作用是络合掉镁等二价金属离子,防止,DNA,酶对质粒分子的降解作用（保护作用）,Tris-HCl,使溶菌液维持溶菌作用的最适,PH,范围（缓冲作用）,8,溶液,II,：由,SDS,（十二烷基硫酸钠）与,NaOH,组成,(,裂解、变性,),SDS,的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性（裂解细胞和蛋白质变性作用）,NaOH,（,PH12,）的作用是破坏氢键，使,DNA,分子变性（,DNA,变性作用）,9,溶液,III,：,HAc,和,KAc,组成的高盐溶液,(,复性，分离,),HAc,溶液,能中和溶液,的碱性，使染色体,DNA,变性而发生缠绕，并使质粒,DNA,复性。,KAc,会与,SDS,形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成沉淀而除去；溶液中的,DNA,也会与蛋白质,-SDS,复合物缠绕成大分子而与小分子质粒,DNA,分离。,四、试剂配制,溶液,：,50mM,葡萄糖，,25mM Tris-HCl(pH 8.0),，,10mM EDTA(pH 8.0),。,1M Tris-HCl(pH 8.0,）,12.5ml,，,0.5M EDTA,（,pH 8.0,）,10ml,，葡萄糖,4.730g,，加,ddH2O,至,500ml,。高压灭菌,15min,，贮存于,4,。,溶液,：,0.2N NaOH,，,1%SDS,。,2N NaOH 1ml,，,10%SDS 1ml,，加,ddH2O,至,10ml,。使用前临时配置。,3.,溶液,：醋酸钾（,KAc,）缓冲液，,pH 4.8,。,5M KAc 300ml,，冰醋酸,57.5ml,，加,ddH2O,至,500ml,。,4,保存备用。,4.TE,：,10mM Tris-HCl(pH 8.0),，,1mM EDTA(pH 8.0),。,1M Tris-HCl,（,pH 8.0,）,1ml,，,0.5M EDTA,（,pH 8.0,）,0.2ml,，加,ddH2O,至,100ml,。,15 lbf/in2,高压湿热灭菌,20min,，,4,保存备用。,5.,苯酚,/,氯仿,/,异戊醇（,25,：,24,：,1,）,6.,乙醇（无水乙醇、,70%,乙醇）,7.5TBE,：,Tris,碱,54g,，硼酸,27.5g,，,EDTA-Na22H2O 4.65g,，加,ddH2O,至,1000ml,。,15 lbf/in2,高压湿热灭菌,20min,，,4,保存备用。,8.RNase A,（,RNA,酶,A,）：不含,DNA,酶,(DNase-free)RNase A,的,10mg/ml,，,TE,配制，沸水加热,15min,，分装后贮存于,-20,。,实验步骤,加,1.5ml,培养物于,EP,管，,12000g30S,除去上清，加入冰的,200,l,溶液,I,，剧烈振荡,EP,管，室温,3min,加入,300,l,溶液,II,，快速颠倒数次，冰浴,3min,加入,400,l,冰,溶液,III,，温和振荡,10s,，冰浴,5min,，,12000g5min,转移上清到新,EP,管，加入等体积,酚,/,氯仿,(1:1),，温和振荡，冰浴,3min,，,12000g5min,上层水相转移到新,EP,管,，加入,2,倍体积,无水乙醇,，颠倒混匀，,-20,冰箱中放置,15min,，,12000g,10min,弃上清，沉淀中加,1ml,70%,乙醇,，,12000g5min,去上清，管平放室温静置,10min,，,20,l TE,溶解,DNA,