质粒DNA的提取纯化与鉴定

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,质粒,DNA,的提取,纯化与鉴定,一、基因克隆的质粒载体,1,、定义,双链闭环,DNA,；,1kb-200kb,；,独立存在于宿主染色体之外；,具复制起始点；,复制和转录不同程度依赖于宿主基因；,编码某些酶，使宿主具有特殊标志，,可供选择。,2,、载体性质,（,1,）,.,复制能力；,（,2,）,.,容纳外源,DNA,的能力；,（,3,）,.,选择标记：抗生素耐受。,（,4,）,.,引入多克隆位点；,（,5,）,.,引入重组选择标记。,3,、载体分类：,按功能分,1.,克隆载体,2.,表达载体,按宿主性质,1.,原核载体,:,质粒载体、粘粒、噬,菌粒、,噬菌体、噬菌体,M13,等,2.,真核载体,:,逆转录病毒、腺病毒、,昆虫杆状病毒,3.,穿梭载体,4,、常用质粒载体,例如：,1.pBR322,、,pUC,18/19,、,pUC118/119,、,pGEM,、,pBluescript,、,pBluescript,SK/KS,等,2.,pET,、,pGEMEX,、,pGEX,等,3.,pALTER,等,5,、常用质粒宿主,：,HB101,、,DH5,、,TG1,、,JM,系列等,BL21,（,DE3,）等,二、质粒,DNA,的分离纯化,试剂的参考配方,:,Solution I,：,50mmo1,L,葡萄糖、,5mmo1,L,三羟甲基氨基甲烷,(Tris)Tris,HCl(pH8.0),、,1.0 mmo1,L,乙二胺四乙酸,(EDTA)(pH8.0),Solution II,：,0.4mo1,L Na0H,，,2,SDS(,十二烷基硫酸钠,),，用前等体积混合,Solution III,：,5mo1,L,醋酸钾,60,mL,、冰乙酸,11.5mL,、水,28.5mL,TE,缓冲液：,10mmo1,L,Tris,HCl,、,1mmo1,L EDTA(pH8.0),（一）、细菌培养物的生长和收获,将,3mL,含,Amp,的,LB,液体培养基加入到两支试管中，接入含重组质粒的大肠杆菌，,37,振荡培养过夜,。,（二）、质粒,DNA,的提取,1,将过夜培养的,2-4m1,细菌，,12,000rpm,高速离心,1,分钟，彻底去除上清。,(,菌液较多时可以多次离心收集菌体,)2,加入,200,l solution I,，用枪头或振荡器充分悬浮细菌。（注：,Solution I,内含,RNaseA,，每次实验结束后，,4,保存。）,3,加入,250,l Solution II,，立即轻柔上下颠倒离心管,5-10,次，使细菌裂解，室温放置,(2-5,分钟左右,),至溶液变成澄清。（注：温度低时，,Soluion,II,有白色沉淀析出，,37,度以下保温溶解，摇匀后使用。）,4,加入,350,l Solution III,，立即轻柔上下颠倒,5-10,次至出现大量白色絮状沉淀，使之充分中和，室温放置,2,分钟。,5,12,000rpm,高速离心,15,分钟。,6,取出,2ml,样品收集管和吸附柱，在管壁标上样品号，将步骤,5,中的上清小心吸取全部转移到吸附柱里。,12,000rpm,离心,1,分钟。,7,取下吸附柱，弃去掉收集管中的废液，将吸附柱放入同一支收集管中，吸取,700,l Wash Solution,到吸附柱，离心,1,分钟。,8,重复步骤,7,一次。,9,取下吸附柱，弃去掉收集管中的废液，将柱放入同,支收集管中，,12,000rpm,高速离心,2,分钟。,10,将吸附柱放入干净的,1,5m1,的离心管中，在柱子膜中央加,30-50,l TE,或灭菌纯水，不要盖上离心管盖，室温下放置,2,分钟；盖上离心管盖，室温,12,000rpm,高速离心,1,分钟。,注意：将,TE,或水预热到,50,左右可以提高洗脱效率。,11,取,1-2,l,洗脱液做浓度测定，,1%,琼脂糖凝胶电泳或酶切分析。,三、质粒,DNA,的鉴定,（一）、紫外光谱分析,通常使用样品的吸光度鉴定其浓度和纯度。,（二）、,EB,荧光分析,（三）、电泳鉴定,在凝胶电泳中，,DNA,分子的迁移速度与分子量的对数值成反比关系。质粒,DNA,经单一酶切后与,DNA Marker,进行电泳对照，即可知该质粒的分子量大小。,质粒的电泳图谱,质粒,DNA,的鉴定和酶切分析,一、质粒的琼脂糖凝胶电泳鉴定,二、质粒的限制性内切酶消化鉴定,实验原理,DNA,分子在高于等电点的,pH,溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖,磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量碱基的双链,DNA,几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。,在一定的电场强度下，,DNA,分子的迁移速度取决于分子本身的大小和构型，迁移速度与,DNA,分子量的对数值成反比关系。,一般提取的质粒有,3,种构型：,超螺旋的共价闭合环状,开环,DNA,，即共价闭合环状质粒,DNA,有一条链断裂,线状质粒,DNA,，即质粒,DNA,在同一处两条链都发生断裂。,通常抽提的质粒在电泳后往往出现,3,条带，其中超螺旋质粒,DNA,泳动最快，,其次为线状,DNA,，,最慢的为开环质粒,DNA,。,实验步骤,1,、制备,1,琼脂糖凝胶：称取,1 g,琼脂糖，放入锥形瓶中，加入,100mL 1TAE,缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀。,2,、胶板的制备,1,）选择适当大小干净的有机玻璃内槽，放好样品梳子。,2,）将冷到,60,左右的琼脂糖凝胶液，加入,3-5l EB,储存液（,2mg/mL,）摇匀，缓缓倒入有机玻璃制胶槽内，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面,(,注意不要形成气泡,),。,3,）待胶凝固后，小心地拔出梳子，将有机玻璃内槽放在电泳槽内。注意：,DNA,样品孔应朝向负电极一端。,4,）加电泳缓冲液至电泳槽中，加液量要使液面没过胶面,1-1.5,毫米。,3,、加样用移液枪将已加入上样缓冲液的,DNA,样品（,5l,质粒,+1l 6,loading buffer),加入加样孔,(,记录点样顺序及点样量,),。,4,、电泳,1,）接通电泳槽与电泳仪的电源。,DNA,的迁移速度与电场强度成正比，一般电场强度不要超过,5V,cm,。,2,）当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿,12cm,处，停止电泳。,限制性内切酶,1.,定义：识别双链,DNA,分子核苷酸序列,并加以切开,2.,来源：细菌的限制修饰系统,3.,特性：识别,4 6,个核苷酸序列,产生平端和粘端,4.,应用：定点切割,酶切产生的末端,（,1,）,G A T,A T C,C T A,T A G,EcoR,酶切产生平端,G A T,P,A T C,C T A,P,T A G,（,2,）,G,A A T T C,C T T A A,G,EcoR,酶切产生,5,突出粘端,G,P,A A T T C,C T T A A,P,G,(3,）,C T G C A,G,G,A C G T C,Pst,酶切产生,3,突出粘端,C T G C A,P,G,G,P,A C G T C,酶切反应,限制性内切酶反应一般在灭菌的,0.5ml,离心管中进行。,20l,体积反应体系,如下：,A:,质粒（,pGEM,-T easy-NGF,）,0.2-1,g,B:10,酶切,buffer 2.0l,C:,限制性内切酶,EcoR,0.5l,D:,加,ddH,2,O,至,20l,37,水浴消化,1,小时。,质粒的酶切电泳,M1 1 2 3 M2,注意事项,购买的限制性内切酶多保存于,50%,甘油中，于,-20,是稳定的。进行酶切消化时，将除酶以外的所有反应成分加入后即混匀，再从,-20,冰箱中取出酶，立即放置于冰上,。,每次取酶时都应更换一个无菌吸头，以免酶被污染。加酶的操作尽可能快，用完后立即将酶放回,-20,冰箱。,尽量减少反应体积，但要确保酶体积不超过反应总体积的,10%,，否则酶活性将受到甘油的抑制。,通常延长时间可使所需的酶量减少，在切割大量,DNA,时可用。在消化过程中可取少量反应液进行微量凝胶电泳以检测消化进程。,