课题3　分解纤维素的微生物的分离 (2)

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,专题二,课题,3,分解,纤维,素的微生物的分离,一、课题背景,纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是含量最丰富的多糖类物质。植物细胞壁的重要成分。纤维素能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。,草食性动物是怎样消化食物中纤维素的？,一、课题背景,除自然环境中存在的分解纤维素的微生物外，在草食性动物等的,消化道,内，也共生有分解纤维素的,微生物,，其原理也是产生,纤维素酶,而分解纤维素，而人没有分解纤维素的能力。,二,、学习目标：,1,、知道纤维素酶的种类及作用,2,、初步掌握从土壤中分离出分解纤维素的微生物的实验方法。,纤维素与纤维素酶,棉花,是自然界中纤维素,含量最高,的天然产物，木材、作物秸秆中也含大量的纤维素。纤维素的分解需要在纤维素酶的催化作用下完成。,请完成下列过程：,纤维素酶是一种,复合酶,，它包括,C,1,酶,、,C,x,酶,和,葡萄糖苷酶,，他们都具有催化分解纤维素的作用。,纤维素,纤维二糖,葡萄糖,1,、基础知识：,2,、纤维素酶活性的测定实验：,纤维素酶水解滤纸试验，右边的试管中加入了纤维素酶，而左边的没有加入,滤纸崩溃法,在,2,支,20ml,试管中，分别放入,1cm6cm,滤纸条，再分别加入,PH,为,4.8,、物质的量浓度为,0.1mol/L,的醋酸,-,醋酸钠缓冲液,10ml,、,11ml,。在加入,10ml,缓冲液的试管中加入,1ml,纤维素酶。将二支试管固定在,50ml,的锥形瓶中，在,140r/min,摇床上振荡反应,1h,，观察结果。,结果？自变量？因变量？无关变量？对照组与实验组。,底物：酶所作用和催化的化合物即反应物,思考,1,实验分析：上述的实验是如何构成对照的？,在一支试管中添加纤维素酶，另一支试管不添加纤维素酶；尽管醋酸,-,醋酸钠缓冲液用量不同，都能维持相同的,PH,。,C,当堂检测,下列生物能分解纤维素的是（ ）,人,兔,牛,蘑菇,纤维杆菌,A,、,B,、,C,、,D,、,3,、纤维素分解菌的筛选,培养方法,-,选择培养,-,选择培养基,(,固体、合成,),以纤维素为唯一碳源,鉴别方法,-,刚果红染色,-,刚果红染色法,刚果红,纤维素,红色复合物,纤维素分解菌,纤维素酶,红色消失,出现透明圈,不同菌落的,透明圈大小,不同，可以说明微生物,产生纤维素酶能力的大小,。,不同菌落的,透明圈大小,不同可以说明什么问题？,四种纤维素分解菌在刚果红培养基上形成的透明圈,透明圈的应用：,筛选,具有某种特定功能,（如分泌某种酶）,的微生物,（,目的菌,）,.,3,、纤维素分解菌的筛选,在,长出菌落,的,培养基,上，覆盖质量浓度为,1mg/mL,的,刚果红,（简称,CR,）溶液，,10,15min,后，倒去,CR,溶液,，加入物质的量浓度为,1mol/L,的,NaCl,溶液,，,15min,后倒掉,NaCl,溶液，此时，产生,纤维素酶的菌落,周围将出现,透明圈,。,先,培养微生物,，,再,加入,刚果红,进行颜色反应。,方法,1,：,NaCl,溶液作用：,漂洗作用,洗去与纤维素结合不牢的,刚果红,，以免出现的透明圈不够清晰。,4,、操作,先,培养微生物,，,再,加入,刚果红,进行颜色反应。,方法,1,：,在,倒平板,时就加入,刚果红,。,方法,2,：,配制质量浓度为,10mg/mL,的,刚果红,（,CR,）溶液，,灭菌,后，按照每,200,mL,培养基加入,1m,L,的比例加入,CR,溶液,，混匀后,倒平板,。等培养基上,长出菌落,后，产生,纤维素酶的菌落,周围将会出现明显的,透明圈。,NaCl,溶液作用：,漂洗作用,洗去与纤维素结合不牢的,刚果红,，以免出现的透明圈不够清晰。,4,、操作,在,倒平板,时就加入,刚果红,。,先,培养微生物,，,再,加入,刚果红,进行颜色反应。,方法,1,：,方法,2,：,染色法,优点,缺点,方法,1,(,后置染色法,）,方法,2,(,前置染色法,）,颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用,操作繁琐。,刚果红会使菌落之间发生混杂。,操作简便，,不存在菌落混杂问题,1.,产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈。,2.,有些微生物能降解色素，形成明显的透明圈。,这两种方法各有哪些,优点,与,不足,？,NaCl,溶液作用：,漂洗作用,洗去与纤维素结合不牢的,刚果红,，以免出现的透明圈不够清晰。,4,、操作,5,、实验设计,土壤取样,选择培养,梯度稀释,将,样品涂布在,鉴别,纤维素,分解菌的,培养基,上,挑选,产生透明圈的菌落（,筛选,）,(1),分布环境,:,富含纤维素,的环境中,生物与环境的互相依存关系,，,在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，,因此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环境。,(2),原因,:,取样的,环境,是怎样的，作出这种选择的,理由,是什么？,纤维素,分解菌大多分布在,富含纤维素,的环境中。因此，选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等等。,5,、实验设计,5.1,、土壤取样,如果,找不到合适的环境，可以将,滤纸,埋在土壤中，将滤纸埋在土壤中有,什么作用,？你认为滤纸应该埋在土壤中,多深,？,将,滤纸,埋在土壤中，能使纤维素分解菌相对集中，实际上是,人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境,。一般应将滤纸埋于深约,10cm,左右,的土壤中。,增加纤维素分解菌的浓度,，以确保能够从样品中分离所需要的微生物。,(1),目的：,思考：用什么方法选择？,5.1,、土壤取样,5.2,、选择培养,纤维素分解菌的,选择,培养基,组分,含量,/g,提供的主要营养,纤维素粉,5,NaNO,3,1,Na,2,HPO,4,.7H,2,O,1.2,KH,2,PO,4,0.9,MgSO,4,.7H,2,O,0.5,KCl,0.5,酵母膏,0.5,水解酪素,0.5,将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到,1 000 mL,碳源、能源,无机盐,生长因子、碳源、氮源,氮源、生长因子,A,、旁栏中的配方是,液体培养基,还是,固体培养基,？为什么,？,是,液体培养基,，原因是配方中,无凝固剂,（琼脂,）,B,、这个培养基对微生物是否具有,选择作用,？如果具有，是如何进行选择的,？,有选择,作用，以,纤维素粉,作为,主要碳源,，,只有,能分解纤维素的微生物可以大量繁殖,。,C,、你能否设计一个,对照实验,，说明选择培养基的作用,。,自变量,为,培养基的种类,（即普通培养基和选择培养基）。可用,牛肉膏蛋白胨培养基,与之对照；或者将,纤维素粉,改为,葡萄糖,。,(2),制备,选择培养基,：,酵母膏，,是以,新鲜酵母乳液,经酶解、分离、浓缩得到的一种棕黄色可溶性膏状（酵母浸膏）或浅黄色粉状（酵母浸粉）纯天然制品,富含蛋白质、必需氨基酸及,B,族维生素、核甘酸、微量元素,等。主要作用是补充,氮源,和提供,生长因子,。,水解酪素,，即水解酪蛋白，酪蛋白水解后得到的白色或浅黄粉末、易溶于水、极易潮解、具有酱香味。,氨基酸种类齐全,。因此常用于制备培养基。主要作用是提供,氮源,和,生长因子,。,纤维素粉,主要碳源,。,液体培养基,选择,培养基,对照实验,牛肉膏蛋白胨培养基,碳源,：,纤维素粉,葡萄糖,(3),操作：,将土样加入装有,30ml,选择培养基,的,250ml,锥形瓶,中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定,温度,下,震荡培养,1,2,天，直至培养液,变浑浊,。也可重复选择培养。,(2),制备,选择培养基,：,(,能分解纤维素的微生物可以,大量繁殖,),为什么？,微生物大量繁殖,在,选择培养,的条件下，可以使那些能够,适应,这种营养条件的微生物得到,迅速繁殖,，而那些,不适应,这种营养条件的微生物的繁殖被,抑制,，因此可以起到“,浓缩,”的作用。,为什么,选择培养,能够“,浓缩,”所需的微生物？,注意：该步骤也可省略，但纤维素分解菌较少。,按照,课题,1,的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比,稀释,10,1,10,7,倍。,10,1,10,2,10,3,10,4,10,5,10,6,5.3,、梯度稀释,5.4,、,将样品,涂布,到,鉴别,纤维素分解菌,的,培养基,上,组分,含量,提供的主要营养,CMC,Na,5,10 g,酵母膏,1 g,KH,2,PO,4,0.25 g,琼脂,15 g,土豆汁,100 mL,将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到,1 000 mL,此培养基为,固体培养基,在其中,加入刚果红,可形成以纤维素分解菌为中心的,透明圈,，据此可,筛选,到,纤维素分解菌,。,(,水溶性羧甲基,纤维素钠,),制备,鉴别培养基,:,碳源,碳源、氮源、生长因子,无机盐,凝固剂,碳源、生长因子,CMC,Na,（,纤维素钠,),主要碳源,。,固体培养基,鉴别培养基,加入,刚果红,（,前置染色法,/,后置染色法,）,出现,透明圈,鉴别,与,筛选,纤维素分解菌,将稀释度为,10,4,10,6,的菌悬液各取,0.1ml,涂布,到平板培养基上，,30,倒置,培养,。,(2),涂布平板,：,制备,鉴别培养基,:,5.4,、将样品,涂布,到,鉴别,纤维素分解菌的培养基上,挑,取,产生明显的透明圈的,菌落（,即为分解纤维素的菌落）,纯化培养,。,5.5,、纯化培养,思考：本实验的流程与,课题,2,中的实验流程有哪些,异同,？,不同,：,课题,2,是将土样制成的菌悬液,直接涂布,在以尿素为唯一氮源的,选择性培养基,上，,直接分离,得到菌落。,本课题通过,选择培养,，使纤维素分解菌得到,增殖,后，,再,将菌液稀释,涂布,在,鉴别（选择）培养基,上,进行,分离和纯化,。,相同,：其他步骤基本一致。,选择,培养基,鉴别培养基,物理性质,唯一,C,源,作用,液体培养基,固体培养基,纤维素,CMC-Na,使纤维素分解菌,迅速增殖,鉴别,与,筛选,纤维素分解菌,纤维素分解,菌,选择,培养基,与,鉴别培养基,比较,土壤取样,选择培养,梯度稀释,将样品涂布到,鉴别培养基,挑选菌落,（,产生明显的,透明圈,）,什么样的环境取样,?,培养的目的? 选择培养基的特点?,鉴别培养基的特点?,如何鉴别?,原因,：微生物对生存环境的要求，到相应环境中去找。,目的：,增加纤维素分解菌的浓度，,以确保能够从样品中分离到所需要的微生物。,刚果红染色法,小,结,思考：本实验的流程与,课题,2,中的实验流程有哪些,异同,？,课题,2:,土壤取样,选择培养基,直接分离,菌落,(,分解尿素的细菌,),以酚红为酸碱指示剂,（尿素为唯一氮源）,选择培养,稀释涂布平板法,课题,3:,土壤取样,选择,培养基,(,纤维素分解菌,),（纤维素为主要碳源）,稀释涂布平板法,鉴别,培养基,透明圈,挑选,菌落,（,刚果红染色法,）,比较项目,分解尿素的细菌,分解纤维素的微生物,选,择,培养,基,原理,培养基类型,目的,鉴,定,培养基,原理,现象,方法,将细菌涂布在,只有,尿素做氮源,的选择,培养基上,将微生物接种在,主要以纤维素粉做碳源,的选择培养基上,固体培养基,液体培养基,筛选菌株,选择培养,课题,2,与,课题,3,相关比较,比较,项目,分解尿素的细菌,纤维素分解菌,选,择,培养,原理,培养基类型,目的,鉴,定,培养基,原理,现象,方法,在细菌分解尿素的化学反应,中，细菌合成的,脲酶,将尿素,分解成了氨，氨会使培养基,的碱性增强，,pH,升高。在培,养基中加入,酚红指示剂,，如,果,pH,升高指示剂会变红,刚果红,可以与纤维素形成,红色复合物，当纤维素被,纤维素酶,催化分解后红色,复合物无法形成，培养基,上就会出现以纤维素分解,菌为中心的,透明圈,观察菌落周围是否有,着色,的,环带出现来鉴定尿素分解菌,观察菌落周围是否出现,透明圈,来筛选纤维素分解菌,脲酶检测法,刚果红染色法,结果,分析与评价,1.,培养基的,制作,是否合格以及选择培养基是否,筛选,出菌落,对照的培养基,在培养过程中,没有,菌落生长则说明培养基制作合格。,如果观察到,产生透明圈的菌落,，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。,2.,分离的,结果,是否一致,由于在土壤中,细菌的数量,远远,高于,真菌和放线菌的数量，因此,最容易,分离得到的是,细菌,。但由于所取土样的环境不同，不同同学也可能,得到真菌,和放线菌等不同的分离结果。,课题,延伸,2,、纤维素酶的,测定方法,:,对,纤维素酶,分解滤纸等,纤维素,所产生的,葡萄糖,含量进行,定量测定,。,为了确定分离得到的是,纤维素分解菌,，还需要进行,发酵产纤维素酶,实验，纤维素酶的发酵方法有,液体发酵,和,固体发酵,。,1,、纤维素分解菌的,鉴定,：,发酵,产纤维素酶,实验,液体发酵,固体发酵,分解,纤维素的微生物的分离,纤维素酶,种类、作用、催化活力,刚果红染色,筛选原理,实验设计,土壤取样,选择培养,涂布培养,纯化培养,前置染色法,后置染色法,富含纤维素土壤,增大分解菌含量,染色鉴别,分离出分解菌,课堂回顾总结,