微生物计数

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,微生物的计数技术,一、测定微生物数量的方法,直接计数法,（总菌计数法）,显微镜直接计数法,间接计数法,稀释平板计数法,（活菌计数法）,液体稀释培养法,比浊法,浓缩法,显微镜直接计数法,是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。,细菌计数板（一般）,-,薄,血球计数板（菌体较大）,酵母菌,霉菌孢子,-,厚,（二者原理和部件相同，只是厚薄不同而已）,直接计数法（,总菌,数测定法）,显微镜直接计数法操作（视频）,1,、优点：所需设备简单，可迅速得到结果，能同时观察微生物形态特征；,2,、缺点：难以计数微小的细菌；难与区分死、活,3,、适用于纯培养悬浮液中各种单细胞菌体的计数,血球计数板是一块特制的厚载玻片，载玻片上有,4,条槽而构成,3,个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个方格网。每个方格网共分,9,大格，其中间的一大格,(,又称为计数室,),常被用作微生物的计数。,血球计数板,计数室的刻度有两种：一种是大方格分为,16,个中方格，而每个中方格又分成,25,个小方格；另一种是一个大方格分成,25,个中方格，而每个中方格又分成,16,个小方格。但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即每个大方格都由,400,个小方格组成。,血球计数板,A.,正面图,B.,纵切面图,1.,血球计数板,2.,盖玻片,3.,计数室,16,小格, 25,中格计数室,25,小格, 16,中格计数室,图,5-2,计数室的两种刻度形式,每个大方格边长为,1mm,，则每一大方格的面积为,1mm,2,，每个小方格的面积为,1,400mm,2,，盖上盖玻片后，盖玻片与计数室底部之间的高度为,0.1mm,，所以每个计数室,(,大方格,),的体积为,0.1mm,3,，每个小方格的体积为,l,4000mm,3,。,使用血球计数板直接计数时，先要测定每个小方格,(,或中方格,),中微生物的数量，再换算成每毫升菌液,(,或每克样品,),中微生物细胞的数量。,已知：,1,毫升,=1cm,3,=1000mm,3,cm,3,体积应含有小方格数为,1000mm,3,（,l,4000mm,3,）,X10,6,计数,左上、左下、右上、右下 左上、左下、右上、右下、中格（,100,小格,） （,80,小格,）,16,中格, 25,小格计数室,25,中格, 16,小格计数室,l.,菌悬液制备,以无菌生理盐水制成浓度适当的菌悬液。每小格内约有,35,个菌体为宜。,2.,镜检计数室在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗，吹干后才能进行计数。,3.,加样品将清洁干燥的血细胞计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，一般计数室均能充满菌液。取样时先要摇匀菌液；加样时计数室,不可有气泡产生,。,操作步骤,4.,显微镜计数加样后静止,5min,，然后将血细胞计数板置于显微镜载物台上，,先用低倍镜,找到计数室所在位置，然后,换成高倍镜进行计数,。在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。位于中格双线上的菌体一般只数上方和左边线上的。如遇芽胞大小达到母细胞的一半时，即作为两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的,平均数,值来计算样品的含菌量。,5.,清洗血细胞计数板使用完毕后，将血细胞计数板在水龙头用水冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。,1.,有压线的菌体，,计上不计下，计左不计右。出芽计一半,。,2.,因菌液在血球计数板处于不同空间，要在不同焦距下才能看全，所以，观察时必须不断调细螺旋（调焦距长短），方可找全,3.,每个样品重复,23,次，若两次差别太大应重测,五、注意事项,死、活细菌的区分,间接计数法,稀释平板计数法,一般将被检样品制成几个不同的,10,倍递增稀释液，然后从每个稀释液中分别取出,1mL,置于灭菌平皿中与营养琼脂培养基混合，在一定温度下，培养一定时间后（一般为,48,小时），记录每个平皿中形成的菌落数量，依据稀释倍数，进行菌落总数的测定，,每,ml(g,),样品中的活菌数,=,（每皿菌落数平均值,/,取样体积）,稀释倍数,特点,1,、由于死亡的细菌不能繁殖成菌落，所以该法只计数活菌数；,2,、该法统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，,原因,是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落；,3,、为使结果接近真实值，可将同一稀释度菌液加到三个或三个以上的平板上，计算菌落平均数。,4,、细菌、放线菌、酵母菌以每个培养皿内有,30-300,个菌落为宜；霉菌以每个培养皿,10-100,个为宜。,平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是，由于该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验,(,如活菌制剂,),，以及食品、饮料和水,(,包括水源水,),等的含菌指数或污染程度的检测,用稀释平板计数时，待测菌稀释度的选择应根据样品确定。样品中所含待测菌的数量多时，稀释度应高，反之则低。,通常测定细菌菌剂含菌数时，,10,-7,、,10,-8,、,10,-9,土壤细菌数量，采用,10,-4,、,10,-5,、,10,-6,放线菌数量，采用,l0,-3,、,10,-4,、,10,-5,真菌数量，采用,10,-2,、,10,-3,、,10,-4,混合平板培养法涂抹平板培养法。,2,平板接种培养,将无菌平板编上,10,-7,、,10,-8,、,10,-9,号码，每一号码设置三个重复，用无菌吸管按无菌操作要求吸取,10,-9,稀释液各,1ml,放入编号,10-9,的,3,个平板中，同法吸取,10,-8,稀释液各,lml,放入编号,10-8,的,3,个平板中，再吸取,10-7,稀释液各,lml,放入编号,10,-7,的,3,个平板中,（由低浓度向高浓度时，吸管可不必更换）,。然后在,9,个平板中分别倒入已融化并冷却至,4550,的细菌培养基，轻轻转动平板,(P112),，使菌液与培养基混合均匀，冷疑后倒置，适温培养。至长出菌落后即可计数。,（,1,）混合平板培养法,（,2,）涂抹平板计数法,涂抹平板计数法与混合法基本相同，所不同的是先将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中，待凝固后编号，然后用无菌吸管吸取,0.1,ml,菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上（每个编号设三个重复）。再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀，每个稀释度用一个灭菌刮铲，更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌。,在由低浓度向高浓度涂抹时，也可以不更换刮铲。,将涂抹好的平板平放于桌上,2030min,，使菌液渗透入培养基内，然后将平板,倒转,，保温培养，至长出菌落后即可计数。,基本操作一般包括：样品的稀释倾注平皿培养,48,小时计数报告。,结果计算,计算结果时，常按下列标准从接种后的,3,个稀释度中选择一个合适的稀释度，求出每克菌剂中的含菌数。,(1,）同一稀释度各个重复的菌数相差不太悬殊。,（,2,）细菌、放线菌、酵母菌以每皿,30,300,个菌落为宜，霉菌以每皿,10,100,个菌落为宜。,选择好计数的稀释度后，即可统计在平板上长出的菌落数，统计结果按下式计算。,每,ml(g,),样品中的活菌数,=,（每皿菌落数平均值,/,取样体积）,稀释倍数,混合平板计数法：,每,ml(,g,),样品的菌数,=,同一稀释度几次重复的菌落平均数,稀释倍数,涂抹平板计效法：,每,ml(,g,),样品的菌数,=,同一稀释度几次重复的菌落平均数,10,稀释倍数,将实验结果填入下表中,菌落计数规则：,（一）选择平均菌落数在,30300,间的平板,1,、只有一个稀释度符合，以该稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告；,2,、有两个稀释度符合，取决于二者比值（高稀释度的菌落数除以低稀释度的菌落数的值）：,若比值小，报告平均数；若比值大于,2,，报告其中较小的数字。,（二）所有菌落数均不在,30300,间,以最接近,30,或,300,的平均菌落数乘稀释倍数,1,、若所有稀释度的菌落平均数均大于,300,，则按稀释倍数最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告；,2,、若所有稀释度的菌落平均数均小于,30,，则按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告；,