丙种球蛋白的制备

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,丙种球蛋白的电泳制备,预习方案,组别：第二组,成员：张婉月 臧赢 徐洁 严梦迎,陈孝颜,指导老师：韦平和 彭佳平,丙种球蛋白概念,中文简称：“丙球” 英文名称：,-globulin,、,gamma globulin,别名： 免疫血清球蛋白，普通免疫球蛋白，人血丙 种球蛋白，丙种球蛋白，静脉注射用人免疫球蛋白 （,pH4,） 丙种球蛋白预防传染性肝炎，预防麻疹等病毒性疾 病感染，治疗先天性丙种球蛋白缺乏症 ，与抗生素 合并使用，可提高对某些严重细菌性和病毒性疾病 感染的疗效。 注：由于人血中的免疫球蛋白大多数为丙种球蛋白 （,-,球蛋白），有时丙种球蛋白也被混称为“免疫球 蛋白”,(immunoglobulin),。,（,2,）药理作用,注射丙种球蛋白是一种被动免疫疗法。它是把 免疫球蛋白内含有的大量抗体输给受者，使之从 低或无免疫状态很快达到暂时免疫保护状态。由 于抗体与抗原相互作用起到直接中和毒素与杀死 细菌和病毒。因此免疫球蛋白制品对预防细菌、 病毒性感染有一定的作用。,（,3,）适应症,丙种球蛋白是血液中一种蛋白质，它通常来源于许多人献的 血液，常被用来防止和治疗感染，对慢性疲劳症有显著的改善 作用。适用于预防传染性肝炎，麻疹等病毒性疾病感染,，治 疗先生性丙种球蛋白缺乏症，可提高对某些严重细菌性和病毒 性疾病感染的疗效。,制备丙种球蛋白的方法,丙种球蛋白的两种分离制备的方法 层析法（如：,SephadexG-50,） 定义,:,是一种利用混合物中诸组分在两相间的分配原理 以获得分离的方法。 电泳法（如：聚丙烯酰胺凝胶电泳,),定义：利用溶液中带有不同量的电荷的阳离子或阴离 子，在外加电场中以不同的迁移速度向电极移动， 而达到分离目的的分析方法。,SEPHADEXG-50,Sephadex,是由葡聚糖通过环氧氯丙烷交联形 成的三维网状凝胶颗粒。,Sephadex,凝胶按交联度不同，用,Sephadex,G,加一个数字来区别型号,数字越小,表示介质交 联度,分级范围越小，反之亦然。,电泳,作用：用于分离蛋白质和寡核苷酸。 原理 聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。 它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶及,SDS-,聚丙烯 酰胺凝胶（,SDS-PAGE,）；非变性聚丙烯酰胺凝胶， 在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依 据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带 的电荷量而逐渐呈梯度分开。,垂直平板：,1,多个样品在同一块凝胶上，电泳条件一致便于利用各 种鉴定方法，直接比较各种样品区带，保证结果的准确可靠,2,可以进行双向电泳,3,电泳时热量容易消散，凝胶结果便于照相和易于制成干胶 圆盘电泳：,1,、缺点是由于聚合效应，凝胶的长度和直径有细微差别， 即使同一样品在两个凝胶柱上以同样的条件电泳，其结果也 会不同,2,、但是研究工作中还会用到圆盘电泳，例如 测定放射性标 记的样品测定蛋白质的生物活性；测定蛋白质分离的最适,pH,， 凝胶浓度；双向电泳中第一相的分离。,聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：,凝胶透明，有弹性，机械性能好； 化学性能稳定，与被分离物不起化学反应； 对,pH,和温度变化较稳定,几乎无吸附和电渗作用；,样品用量少，灵敏度可达,10-6g;,凝胶孔径可调节；,分辨率高。,凝胶系统的分类,1,、连续性凝胶电泳,连续系统电泳体系中缓冲液,pH,值及凝胶浓度相同， 带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。 不连续系统中由于缓冲液离子成分，,pH,，凝胶浓度 及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不 仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应。,2,、不连续凝胶电泳,垂直电泳原理,阴极电泳用水溶性树脂是一种阳离子型化合物，用 有机酸中和，在水中溶解后，以分子和离子平衡状 态存在于直流电场中，两极产生电位差，离子发生 定向移动，阳离子向阴极移动，并在阴极表面上得 到电子沉积于阴极表面，而阴离子向阳极移动，在 阳极上放出电子氧化成酸。这就是电泳涂装的基本 原理。它是一个非常复杂的电化学反应，其中包括： 电解、电泳、电沉积、电渗四个同时进行的过程。,实验步骤,（,1,）溶液的配制,a) a,贮液为,49.5%T,3%C b) b,贮液为,49.5%T,6%C,。,c),胶缓冲液为,3molTris d) 0.3g/LSDS,用,HCl,调,pH,值至,8145 e),阳极缓冲液为,0.2molTris f),用,HCl,调,pH,值至,8.9,。,g),阴极缓冲液为,0.1molTris h) 0.1molTricine i) 0.13g/LSDS,用,HCl,调,pH,值至,8125,。,j),样品缓冲液为,3molTris(pH8.45) k) 0.8gSDS l) 0.3molDTT m),少许溴酚蓝,定容至,10ml,。,n),胶的制备,:,按文献分别配制分离胶、间隙胶和浓缩胶,依次 灌胶。,(2),样品处理,去除血清白蛋白后的样品与,2,倍体积,U9,缓冲液,(9molUrea,2%CHAPS,1%DTT),混匀,400,600r/min,冰浴振荡,30min,变性。取变性后样品与样品缓冲液 等体积混匀,60,水浴加热,5min,。,(3),电泳,内槽装阴极缓冲液,外槽用阳极缓冲液恒压 电泳,先,40V,约,1.5h,当样品进入分离胶时,电 压升至,60V,约,1.5h,。,(4),染色和脱色,电泳结束时,用双蒸水把胶面洗净。臵于染 色液,(0.1%,甲醇,0.5%,三氯乙酸,0.1%,考马斯 亮蓝,G250),中,50,60r/min,振荡染色,1h,。 然后用双蒸水洗净胶面,转至双蒸水脱色,1h,。 更换双蒸水,23ci,直到背景清晰。,盘状电泳,圆盘电泳是带电粒子,(,胶体颗粒、离子等,),在电场的 作用下在特定的介质中向与其电荷性质相反的电极 方向定向泳动的现象,.,广泛应用于生物大分子的分离 和鉴定。 它是利用丙烯酰胺和双丙烯酰胺在催化剂的作用下 聚合成大分子的凝胶物。它同时兼有分子筛和电泳 效应。当样品通过凝胶进行电泳时，便可以根据其 样品中各分子的电荷和分子量的不同而泳动出不同 的区带。由于聚丙烯酰胺凝胶化学性质较琼脂稳定， 很少带有侧基，在电泳过程中，吸附作用与电渗作 用均小，所以该技术的分辨率均高于其它琼脂电泳 技术。,聚丙烯酰胺凝胶电泳的三种效应,1,、 浓缩效应 每种蛋白质分子所载有效电荷不同，因而迁移率不 同。 有效电荷多的，泳动的快，反之则慢。,2,、电荷效应 分子量大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径的分 离胶时，受凝胶阻滞的程度不同，表现出不同的 迁移率。,3,、分子筛效应 样品在分离之前，首先在浓缩胶得到浓缩，变成狭 窄（很薄）的样品带，使分辨率大大提高。,实验方法,分离胶的制备,浓缩胶的制备,待分离样品的准备,加样,电泳,染色,脱色,材料与试剂,1,20,单体母液 丙烯酰胺（,Aorylamide,）,19.60g,双丙烯酰胺（,N,，,N,methylene,Bisaerylamide,）,0.40g H2O,加至,100.00ml 2,pH8.0,Tris,EDTA,缓冲液,Tris,（三羟基甲基氨基甲烷）,6.05g EDTA,（乙二胺四乙酸）,1.17g H2O,加至,100.00ml 3,B,三甲基胺基丙腈液（,BDMPN,） （,Dimethylaminopropionitrile,），原液于,4,冰箱保存,4,10,过硫酸铵溶液 过硫酸铵,0.50g H2O,加至,5.00ml,现用现配或配后低温保存不超过一周。,5,0.025Mol/L pH9.0,硼酸缓冲液 硼酸,3.948g,硼砂,30.512g H2O,加至,1000.0ml,使用时取该液,90ml,加,H2O,至,1 440ml,，即为电泳液。,五、操作步骤,1,、分离胶的制备：,（,1,）、将清洁、无破碎干燥的小玻管一端，用胶布贴封后，朝 下垂直放入有机玻璃凝胶玻管架的孔中，并在小玻管的,7.0 cm,处作一记号。 （,2,）用自动取液器吸取上述配好的分离凝胶贮液沿着小玻管内 壁小心准确加入,7.0 cm,高。 （,3,）凝胶溶液加毕后，随即吸取蒸馏水，加至管中的凝胶表面， 使其表面覆盖一水层（水封，,1.0cm,高）。在灌胶和封水的过 程中，操作要轻，以避免产生气泡。 （,4,）将加注好的凝胶管于室温下静置，以进行聚合反应，在正 常情况下大约,30-60,分钟后，待界面出现明显分层现象时，表明 胶已聚合完毕，即可加浓缩胶。,2,、浓缩胶的制备：,（,1,）、轻轻倒掉分离胶玻管上端的液体，并用吸 水纸吸去未倒净的液体（但不能触及胶面）然后先 小心用浓缩胶贮液洗涤凝胶表面,1-2,次，再小心加 入该浓缩胶贮液,1.5 cm,高。 （,2,）、随后同样加,1.0cm,高的蒸馏水层覆盖胶表 面。大约也在,20-40,分钟后，待浓缩胶出现乳白色 时，表明胶已聚合完毕。,3,、加样： 取一根上次做好的凝胶小玻管用吸水纸轻轻吸去 浓缩胶表面上的水层，然后用微量注射器加,10ul,测 试样品溶液。,4,、装置凝胶管： 将加好样品的凝胶管的加样端（上端），插入上电 泳槽孔中，然后将已插满凝胶管的上电泳槽放入加有 电极溶液的下电泳槽内。此时凝胶玻管下端管口易产 生气泡，可通过轻轻摆动凝胶玻管以去除气泡，插入 上电泳槽的玻管上端，用滴管轻轻滴满电极溶液，以 免产生气泡，最后将上电泳槽装满电极液。,5,、接通电源：,接通电泳槽的两端电极与电泳仪的电源，上槽电极接 负极，下槽电极接正极，稳压,300V,电泳开始时，电流 应由小逐步加大至额定值。这时的电流大约每管,3.05.0,mA,电流，直至指示剂前沿到达凝胶管底部约,0.5 cm,处，（大约需时,2,小时），停止电泳。确定电泳结 束时，不应将溴酚兰跑出凝胶管，以防止标准分子量 中的最低分子量蛋白质也跑出凝胶管。,6,、练习取出玻管内的凝胶：,将一支带有长针头的注射器吸有适量水（蒸馏水 或自来水），把针头慢慢插入玻管内壁和凝胶柱表 面之间，一边开始压水，一边同时使针头慢慢贴紧 管壁呈螺旋式前进，如果一端不行，再在管的另一 端按同样的方法剥离，这样依靠水流的压力和滑润 力，使玻管内壁与凝胶分离，最后用洗耳球在管的 一端轻轻挤压，另一端对着一干净大小适宜的培养 皿内，此时可以将凝胶柱压出玻管。,7,、取出玻管内的凝胶,8,、凝胶染色：,将取出的凝胶柱，放入一合适干净的培养皿内，然 后加入适量染色液，于摇床上进行振摇染色,30,分钟， 完毕，回收染色液，用清水洗凝胶柱,2-3,遍。在染色的 同时，凝胶中蛋白质区带亦被固定。,9,、凝胶脱色： 在培养皿（或试管）内加入适量脱色液于摇床上进 行振摇（,2,小时,/,次，需,3,次）脱色多次直至色带完全清 晰为止。,10,、绘图：,最后根据染色所出现的带数和位置进行绘图， 以确定被分析样品的组分。另一种方法是通 过密度扫描仪扫出各组分的峰形位置，这样 不仅能确定组分，而且能比较出各组分所占 比例（如果要计算出各分离区带的相对迁移 率，可参考教课书）。,注意事项,样品的离子强度、,pH,值尽可能与浓缩胶溶液相同， 如含大量盐类时，应透析除盐。最适合的样品蛋白 量是,10g,100g,，加入样品量要少，血清样品,3l,5l,，免疫球蛋白样品可加,15l,20l,。 凝胶柱面应平整，操作过程切勿产生气泡，否则电 泳区带不整齐。 电泳中电流应保持稳定，避免电流强度过高，而产 生大量的热使分离失败。 电泳开始，样品应于,5min,10min,内进入凝胶柱内 为佳。 药品大部分有毒，应注意防护。,友情提示,:,分 离 胶,: 7.0 CM,浓 缩 胶,: 1.5 CM,上 样 量,: 10,ul,稳 压,: 300 V,电泳时间,: 1:30,小时 染色时间,: 30,分钟,