研究生实验测序引物设计方法介绍及注意事项

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,测序引物设计方法介绍及注意事项,一、PCR引物设计方法：,1.,引物最好在模板,cDNA,的保守区内设计。,DNA,序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在,NCBI,上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如,DNAman,）比对（,Alignment,），各基因相同的序列就是该基因的保守区。,2.,引物长度一般在,1530,碱基之间。,引物长度（,primerlength,）常用的是,18-27bp,，但不应大于,38,，因为过长会导致其延伸温度大于,74,，不适于,TaqDNA,聚合酶,进行反应。,3.,引物,GC,含量在,40%60%,之间，,Tm,值最好接近,72,。,GC,含量（,composition,）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的,GC,含量不能相差太大。另外，上下游引物的,Tm,值（,meltingtemperature,）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，,50%,寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于,Tm,值,510,。若按公式,Tm=4,（,G+C,）,+2,（,A+T,）估计引物的,Tm,值，则有效引物的,Tm,为,5580,，其,Tm,值最好接近,72,以使复性条件最佳。,4.,引物,3,端要避开密码子的第,3,位。,如扩增编码区域，引物,3,端不要终止于密码子的第,3,位，因密码子的第,3,位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。,5.,引物,3,端不能选择,A,，最好选择,T,。,引物,3,端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为,A,时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为,T,时，错配的引发效率大大降低，,G,和,C,错配的引发效率介于,A,、,T,之间，所以,3,端最好选择,T,。,6.,碱基要随机分布。,引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是,3,端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（,Falsepriming,）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其,3,端不应超过,3,个连续的,G,或,C,，因这样会使引物在,GC,富集序列区错误引发。,7.,引物自身及引物之间不应存在互补序列。,引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（,Hairpin,）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续,4,个碱基的互补。,两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免,3,端的互补重叠以防止引物二聚体（,Dimer,与,Crossdimer,）的形成。引物之间不能有连续,4,个碱基的互补。,引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其,G,值不要过高（应小于,4.5kcal/mol,）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使,PCR,反应不能正常进行。,8.,引物,5,端和中间,G,值应该相对较高，而,3,端,G,值较低。,G,值是指,DNA,双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，,G,值越大，则双链越稳定。应当选用,5,端和中间,G,值相对较高，而,3,端,G,值较低（绝对值不超过,9,）的引物。引物,3,端的,G,值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发,DNA,聚合反应。（不同位置的,G,值可以用,Oligo6,软件进行分析）,9.,引物的,5,端可以修饰，而,3,端不可修饰。,引物的,5,端决定着,PCR,产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物,5,端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、,Eu3+,等；引入蛋白质结合,DNA,序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。,引物的延伸是从,3,端开始的，不能进行任何修饰。,3,端也不能有形成任何二级结构可能。,10.,扩增产物的单链不能形成二级结构。,某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件（比如,RNAstructure,）可以预测估计,mRNA,的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（,G,）小于,58.6lkJ/mol,时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用,7-deaza-2-,脱氧,GTP,取代,dGTP,对扩增的成功是有帮助的。,11.,引物应具有特异性,引物设计完成以后，应对其进行,BLAST,检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。,值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如,GC,含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作,克隆,目的的,PCR,，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。,做,RealTime,时,用于,SYBRGreenI,法时的一对引物与一般,PCR,的引物,在引物设计上所要求的参数是不同的。,