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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,粗糙链孢霉的分离和交换,实验目的,1.,用粗糙链孢霉的赖氨酸缺陷型和野生型进行杂交，并观察杂交所得后代的子囊孢子的分离和交换现象。,2.,掌握顺序排列四分体的遗传学分析方法，进行有关基因与着丝粒距离的计算和作图，加深理解基因分离和连锁交换规律。,实验原理,粗糙链孢霉,(,Neurospora,crassa,，,2n,14),，又称红色面包霉，在分类学上属于真菌中的子囊菌纲、球壳目、脉孢菌属，目前已知有,4,5,种。利用粗糙链孢霉进行遗传学分析有如下优点：个体小，生长快，容易培养；既可进行有性繁殖，又可进行无性繁殖，一次杂交可产生大量后代；染色体与高等生物一样，研究结果可广泛应用于遗传学上；无性世代是单倍体，没有显隐性，基因型可以直接在表型上反映出来；一次只需分析一个减数分裂的产物，就可以观测倒遗传结果，简单易行，而二倍体合子是两个不同减数分裂产生的配子相互结合的结果，需要通过测交实验才能分析减数分裂的结果，手续麻烦。因此粗糙链孢霉是进行基因分离和连锁交换遗传分析的好材料。,粗糙链孢霉的营养体是由单倍体（,n,7,）的多细胞菌丝体和分生孢子所组成，生活方式由有性和无性两种。菌丝经有丝分裂直接发育成菌丝体，称无性生殖。而两种不同接合型细胞结合产生有性孢子的过程称有性生殖。,无性繁殖过程，由菌丝顶端断裂形成分生孢子。分生孢子有两种，小型分生孢子中只含有一个核，大型分生孢子有几个核。分生孢子萌发成菌丝，可以再生成分生孢子，周而复始（见下图）。,在有性生殖过程中，粗糙链孢霉的菌株有两种不同接合型,(mating type),，它们受一对等位基因控制。不同接合型菌株的细胞接合产生子囊果及子囊孢子。,粗糙链孢霉的生活史,1,3,为无性繁殖；,4,9,为有性繁殖。图中间示基因交换发生位置及子囊,孢子的排列顺序，（,1,）（,2,）为非交换型；（,3,）（,4,）（,5,）（,6,）为交换型,粗糙链孢霉的子囊孢子是单倍体细胞，由它发芽长成的菌丝体也是单倍体。所以由一对等位基因决定的性状在,F1,就能分离。并且，它的一次减数分裂产物包含在一个子囊中，可以直接观察到基因分离，并证明基因在染色体上。同时，再一次有丝分裂后，,8,个子囊孢子有顺序地排列在子囊中，就可以测定着丝粒距离和发现基因转变。,交换型子囊的出现，是由于核基因与着丝点之间发生了一次染色体片段的交换的结果，即由第一次分裂分离形成的子囊为非交换型子囊，第二次分裂分离形成的子囊为交换型子囊，因而第二次分裂分离的子囊数量愈多，表明有关基因和着丝粒的距离愈远。根据第二次分裂分离子囊的频数，就可以计算出某一基因和着丝粒间的距离，这距离称为着丝粒距离。由于交换只发生在二价体的,4,条染色单体中的,2,条之间，当每发生一次交换时，便产生一个第二次分裂分离子囊，所以交换型子囊中仅有一半子囊孢子属于重组类型，因此必须将第二次分裂分离子囊的百分率除以,2,，就是某一基因与着丝粒间的重组值，计算公式如下：,着丝粒和基因间的重组值,重组值除去，即为图距：,某基因的着丝粒距离 图距单位,实验器具和药品,1.,仪器用具：显微镜、镊子、解剖针、接种针、载玻片、试管、酒精灯、滤纸。,2.,药品试剂：,CaCl2,、,NaCl,、,NH4NO3,、,MgSO4.7H2O,、,KH2PO4,、蔗糖、酒石酸铵、生物素、赖氨酸、,5,次氯酸钠、,5,石炭酸、,3,来苏尔、蒸馏水、苯酚、琼脂、马铃薯、玉米粒。,实验材料,粗糙链孢霉野生型菌株,(,Lys,),，赖氨酸缺陷型菌株,(,Lys,),。,实验步骤,1.,菌种活化,进行杂交实验前，要先把冷冻保存的菌种活化。把野生型和缺陷型菌种分别斜面接种到各自的试管培养基上，置于,28,恒温培养箱中培养,57,天，直至菌丝上部有分生孢子产生，长好的菌株在菌丝上部可见红粉状孢子。保存和活化可用马铃薯培养基。,2.,接种杂交,在无菌条件下，先将接种环挑取,lys,-,菌株的菌丝或分生孢子，团块直径约,36mm,，接种于杂交培养基上，再挑取,Lys,+,菌株的菌丝或分生孢子，团块直径约,12mm,，接种在同一杂交培养基上，让其杂交。接种时，试管口应靠近火焰，以防污染，并贴上标签，然后放在,25,恒温培养箱中培养，约经,14,天左右，可看到棕黑色的成熟子囊，此时即可在显微镜下观察分析。观察时要注意掌握好孢子的成熟程度，如过早，子囊中的孢子尚未成熟而呈白色，若偏迟，则孢子全为黑色，对交换型和非交换型孢子难于区别。要掌握适宜的观察时期，最好是在子囊壳开始变黑时，每天取几个子囊果压片观察，当看到适合时即置于,4,5,冰箱中，可保存,3,4,周，延长观察时间。,3.,压片观察,将附有子囊果的滤纸条放入,3,来苏尔溶液中处理,10min,，杀死孢子，以防孢子飞扬污染实验室。取一载波片，滴一滴,3,来苏尔溶液，然后用接种针跳出子囊果放在载波片上，用镊子柄平压，或盖上另一载波片，用手指压片（这里用载波片盖上压片而不用盖玻片，是因为子囊果很硬，盖玻片易破裂），压片时要适当用力压破子囊果，使子囊呈放射状逸出，但要注意不能让分生孢子散出，一个子囊果中会散出,30,40,个子囊。压片时最好一次一个子囊果，多了压不好。片子压好后，置于,100,显微镜下观察，观察时要顺时针方向观察，自中心向外确定子囊类型，计数并做好记录。此过程不需无菌操作，但也要注意对观察过的载玻片，用过的镊子和解剖针等用具都需放入来苏尔溶液中浸泡后取出洗净，以免污染实验室。,粗糙链雹霉,lys,+,与,lys,-,杂交子囊孢子的排列方式,图中（,1,）（,2,）为非交换型；（,3,）（,5,）（,6,）缺少（,4,）为交换型子囊,作业,1,观察一定数目的子囊果，记录每个完整子囊的类型，按不同的子囊类型计数填入表中，计算,Lys,基因与着丝粒间的距离。,子囊类型,孢子排列方式,观 察 数,合 计,非交换类型,（第一次分离裂）,1,2,交换类型,（第二次分离裂）,3,4,5,6,2.,分析粗糙链雹霉的子囊孢子分离和交换现象与高等动物、高等植物的性状分离和交换有什么不同，本实验结果说明了什么？,
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