2005分子病理学课件1

单击以编辑,母版标题样式,单击以编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,病理学研究中常用的分子生物学基本技术及其应用,病理教研室,分子病理学基本概念,现代分子生物学,vs,传统病理学,疾病发生过程中,分子事件及其与疾病发生的关系,揭示 根本机制,复习有关的分子生物学概念,(1),核酸的结构与功能,核酸,-,多核苷酸,。,核酸,由,核苷酸,组成,核苷酸,由,碱基,、,核糖,/,脱氧核糖,和,磷酸,构成,碱基,有五种,：,A,腺嘌呤,T,胸腺嘧啶,U,尿嘧啶,G,鸟嘌呤,C,胞嘧啶,核苷酸,连接方式,核酸,-,DNA,（,脱氧核糖核酸）和,RNA,（,核,糖核酸）,DNA,和,RNA,的差别,从结构上看,DNA,：,含脱氧核糖及胸腺嘧啶,ACGT,RNA,：,含核糖及尿嘧啶,ACGU,从功能上看,DNA,：,构成染色体内的基因组、细胞器基因,组，是遗传信息的贮存和,携带者,RNA,：,包括,mRNA(,信使,RNA),rRNA,(,核糖体,RNA),tRNA,(,转移,RNA),，,分别进行,转录、转译的功能,DNA,结构,一级结构,即,DNA,分子中脱氧核苷酸的排列顺,序碱基顺序就代表了核苷酸顺序。,又称为核苷酸序列或碱基序列,二级结构,即,DNA,分子的双螺旋结构,这种双螺旋结构的一个重要特征是,：在一定条件下，双链可解开，亦可重新形成双链,三级结构,DNA,超螺旋结构,DNA,复制,双链解链 各自为模板合成新的互,补链,DNA,转录,以,DNA,为模板合成,RNA,过程,DNA,翻译,蛋白质合成的同义词以遗传密码,破读的手段转变为蛋白质的氨基,酸排列顺序,如,GGC,甘氨酸,GTC,颉氨酸,遗传信息贮存于,DNA,，,在核内通过转录成,mRNA,，,在胞浆内,mRNA,作直接模板来指导翻译,(2),基因,(gene),基因表达是指基因的转录翻译以及它们的调控,转录在胞核内进行，翻译在胞浆中进行,(3),染色质,(chromatin),主要成分是,DNA,和,蛋白质， 细胞间期,光镜下呈细颗,粒状,染色体,（,chromatosome,）,主要成分同上， 细胞分,裂期，由染色质浓集而成，呈杆状,有恒定数目,同一物质在不同时期的形态变化,(4),蛋白质,一级结构,多肽链氨基酸排列顺序,序列改变,构型改变, 功能改变,二级结构,局部,/,某一段肽链空间位置,三级结构,(,三维结构）整条肽链空间位置,四级结构,多条肽链位置,真核生物基因组,单复制顺序,（,single copy sequence,）,在整,个,DNA,分子中只出现一次或少数几次,中等重复顺序,(,moderatelyrepetitivesequences,),在,DNA,分子中重复出现几十到几千次,高重复顺序,(highly,tepetitive,sequence),在,DNA,分子中重复几百万次,反转重复顺序,(inverted repetitive,sequerce,),其特点是一段碱基呈,回文结构,回文结构,（,palindromic,structure,）,又称,发夹结构,(hairpin structure),如：,5 AAGCTAGCTT3,3 TTCGATCGAA5,其中,一条单链回折又可形成双链,3 T T C G A, ,5A A G C T,内含子与外显子,内含子,（,intron,）,或,插入顺序,外显子,（,exon,）,DNA,变性,定义,变性后性质,变性条件,DNA,复性,（,renaturation,）,退火,影响复性因素,简单分子快于复杂分子,小分子快于大分子,DNA,浓度高快于浓度低,离子强度高（盐浓度高）快于离子强度低,cDNA,mRNA,的互补拷贝,cDNA,缺乏该基因的内含子，但含有为产生功,能蛋白质所需的全部编码信息,寡核苷酸,一,.,病理学研究中常用的分子生物学基本技术,(,一,),核酸分子杂交,（,nucleic acid molecular,hybridisation,）,技术,概念,具有一定同源性的核酸单链,一定条件下碱基互补退火形成双链,用带有标记的具有特殊碱基序列（已知碱,基序列）的一段,DNA,或,RNA,单链片段,来检测靶核酸（待测核酸）中是否存在与之,同源的序列,已知的核酸序列,即探针,（,probe,）,探针标记,1.,固相杂交,(solid-phase hybridization),概念,固体支持物有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、乳,酸颗粒、磁珠和微孔板等,基本方法,： 在此以膜相为例,(1) DNA,变性,：使,DNA,由双链解链成为单链。,是成功的关键,(2),变性,DNA,在硝酸纤维素膜上的固定,(3),预杂交,(4),杂交,(5),洗膜,(6),结果显示,A.,放射性测定,放射自显影法,液闪记数法,B.,非放射性检测法,AP,显色系统，,NBT,（,四,氮唑蓝）显色,分类,(1),菌落原位杂交,（,colony in situ hybridization,）,菌落转到膜上,将滤膜上的菌落裂解以释出,DNA,(2),斑点杂交,（,Dot blot,）,最简单有效的膜杂交方法,核酸原液或纯化的标本直接点到膜上,斑点杂交应用于,DNA,斑点杂交,RNA,斑点杂交,对于培养细胞，不必提取和纯化,RNA,，,只需简单处理,(0.5%Nonidet P40,低渗缓冲液,),完整细胞斑点杂交,NaOH,处理，使,DNA,暴露,可用于筛选大量标本，但它不适用于非放射性 标记探针,(DNA,纯度不够,),斑点杂交的特点,优点,A,操作简便、快速，事先不用限制性内,切酶消化或凝胶电泳分离核酸样品,B,可在同一张膜上进行多个样品的检测,C,可作半定量分析,缺点,A,不能鉴定所测基因的相对分子量,B,特异性较差，有一定比例的假阳性,(3),印迹杂交,（,blotting hybridization),southern,印迹杂交,（,southern blotting hybridization,）,1975,年由,Southern,创建,多用,限制性内切酶,将,DNA,切成片段进行,凝胶电泳分离,（分开）,凝胶上使,DNA,变性,原位,将单链,DNA,片段转移,固相支持物,上,再与相应的已标记的,探针,进行,杂交,反应,用放射性自显影或酶反应显色，,确定探针互补的每一条,DNA,带的位置,可用于,DNA,图谱分析,基因克隆鉴定,（克隆基因的酶切图谱分析）,基因构成研究,（基因组的定性及定量,分析、基因突变分析及限制性长度多,态性分析（,RFLP,）,等。）,，,northern,印迹杂交,（,Northern blotting hybridization,）,其被测样品是,RNA,方法与,southern,印迹杂交类似,此法常用于基因表达的研究,，可推算出癌基因的表达程度,(4),原位杂交,（,in situ hybridization,）,核酸原位杂交,（,nucleic acid hybridization in situ,）,的简称,已知碱基顺序并带有标记的核酸作为探针,与细胞组织切片中待测的核酸 特异性结合 成杂交体,应用与标记物相应的检测系统,在被检测的核酸原位检测杂交信号,首创 放射性标记,(1969),荧光素标记,(1981),生物素标记,(1983),其与菌落原位杂交不同,原位杂交可以确定探针的互补序列在细胞内的空间位置,用途,检测特定,DNA,序列在细胞核或染色体上,的特定位置分布,检测细胞内,RNA,在细胞中和组织中的,分布及特定基因表达水平；,检测 细胞、组织中有无特异性,病原菌,、,病毒,优点,：,A,特异性高，可精确定位,对于组织中,含量极低的靶序列有极高的敏感性,B,能在成分复杂的组织中进行单一细,胞的研究而不受同一组织中其它成,分的影响,C,不需要从组织中提取核酸,D,可完整的保持组织与细胞的形态，准确反,映其与组织细胞的相互关系,原位杂交与免疫组化方法结合,免疫组化,检测抗原成分，在翻译水平上研究基因表达,原位杂交,检测,DNA/RNA,，,进行基因定位，在基因扩增或在转录水平上研究基因表达,原位杂交的探针,单链,DNA,双链,DNA,RNA,探针,基本方法,(RNA,杂交为例,),A.,杂交前准备,固定,尽快予以冷冻,/,固定,培养细胞、新鲜组织、石蜡包埋组织均可进行原位杂交,通常石蜡包埋信号低于冰冻切片,玻片处理,增强组织通透性和探针穿透性,稀释的酸去垢剂,（,detergent,）,或,清洗剂,Triton X 100,某些消化酶,应掌握其用量及孵育时间,减低背景染色,充分洗涤,预杂交,杂交后低浓度,RNA,酶处理,防止,RNA,酶污染,B.,杂交,C.,杂交后处理,D.,显示,如,AP,显色系统,NBT,（,四氮唑蓝）显色等,有两种方法,:,直接法,直接标记探针,间接法,抗原标记探针,杂交后,再用特异性,标记的抗体反应,在呈色,双重原位杂交方法,通常有两种方法,A,.,用,相邻,的,连续,切片（,3,），,用,两种,不同的,探针,进行原位杂交,适用于较大细胞的研究,优点,二者杂交过程和结果互不干扰,显示方法和呈色可用同一检测系统，敏,感性相同，可比性强,缺点,杂交信号可能因切片较薄而减弱,寻找同一细胞的切面进行分析有一定困难,B,.,用两种探针在同一标本上作原位杂交，两种不同标,记探针的杂交阳性信号呈色不同,(5),荧光原位杂交,（,fluorescence in situ hybridization , FISH,）,技术,基本原理,生物素、地高辛或荧光素标记,特异的,DNA,探针,对外周血、肿瘤细胞或癌前组织的离散培养,细胞的,染色体,铺片或切片（包括石蜡切片）,DNA-DNA,原位杂交,荧光素标记抗探针标记物的抗体,其杂交定位信号用荧光法显示。,可用多种荧光素的不同颜色显示多个染色体的结构或,DNA,。,如,FITC,(,fluorescien,isothiocy-anate,异硫氰,酸荧光素,) ,呈黄绿色,Texas,红,呈红色,特点,操作简易，快捷,探针标记后稳定,方法敏感,在同一标本上可以同时检测几个不同的基因,不仅可以在染色体分裂相上观察结果，而且可以应用,于培养的间期细胞，组织的石蜡切片、冰冻切片,应用,临床应用,应用非常广泛,研究应用,肿瘤中染色体异常,基因图谱绘制,确定基因在染色体上的顺序,(6),其它杂交方法,A.,差异杂交,（,differential hybridization,）,B.,cDNA,微点阵杂交,（,cDNA,microarray,hybridization,）,C.,寡核苷酸微点阵杂交,（,oligonucleotide,microarray,hybridization,）,2.,液相杂交,（,solution hybridization,）,所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中,(1),吸附杂交方法,HAP,（,羟基磷灰石）吸附杂交方法,(DNA:DNA),亲和吸附杂交方法,(DNA:RNA),生物素标记,DNA,探针,酰化亲和素包被固相支持物,用特异性抗,DNA-RNA,杂交物的酶标单克隆抗,体与固相支持物上的杂交物反应,酶显色,磁珠吸附杂交方法,吖,啶翁酯（,acridinium,ester,）,标记探针,吸附在磁化的有孔小珠,(2),发光液相方法,能量传递法,两个紧接的探针，一个探针的一端用化学发,光基团（供体）标记，另一个探针的一端用荧,光物质标记，并且这两个探针靠得很近。,由于只有在两个探针分子靠得很近时，才能产,生发光具有较好的特异性,吖,啶翁酯标记法,检测杂交探针的化学发光 此法敏感度低,仅适用于检测扩增的靶序列,(3),液相夹心杂交方法,亲和杂交方法,两个探针与靶核酸杂交，形成夹心结构。,杂交物上的吸附探针可结合到固相支持物上,杂交物上的检测探针可产生检测信号,一般用生物素标记吸附探针，用,125I,标记检,测探针,该试验保持了固相杂交的高度特异性,(,二,),聚合酶链反应及其相关技术,1.,聚合酶链反应,（,polymerase chain reaction , PCR,）,技术,又称体外基因扩增,利用,DNA,变性和复性原理在体外进行特定的,DNA,片段高效扩增的技术,获得或放大特异基因信号的重要手段,基本原理,在模板,DNA,（,待测,DNA,）,引物（模板两端的已知序列）,四种脱氧核苷酸,(,dNTP,),DNA,聚合酶依赖的酶促合成反应,扩增的特异性取决于引物与模板,DNA,整个步骤分三步,变性 加热 模板,DNA,成两条单链,退火 降温 模板,DNA,与引物 互补结合,延伸,DNA,聚合酶及镁离子 形成与模板链,互补的新,DNA,链,三步为一个循环,DNA,量增加,1,倍,25-30个循环,DNA,可增加,10,6,-10,9,倍,PCR,反应体系组分包括,引物,DNA,聚合酶,PCR,反应缓冲液,dNTPs,（,四种核苷酸）,实际操作中,分别有不同的要求和注意事项,反应条件应不断优化,如 变性 复性 延伸温度及时间,循环参数,镁离子浓度,平台效应,防止污染等,PCR,模板（待测,DNA,）,细菌,全血标本或白细胞,新鲜组织,石蜡包埋组织,但各自的制备方法各异,PCR,扩增产物的检测分析,凝胶电泳分析 琼脂糖凝胶电泳,(,最常用,),聚丙烯酰胺凝胶电泳,单一条带,点杂交方法 将产物直接点到膜上,2. PCR,相关技术,(1),定量,PCR,最常用的为竞争性,PCR,(2),逆转录,PCR,(RT-PCR),用来扩增,RNA,的方法,由,mRNA,逆转录（,reverse transcription, RT,）,反应产生的,cDNA,第一条链作,PCR,的模板,(3),竞争逆转录,PCR,(competitive,reverst,transcription-polymerase chain reaction, c-RT-PCR),(4),多重,PCR,( multiplex PCR),(5),反向,PCR,(inverse PCR),对已知,DNA,片段两侧未知,序列进行扩增,(6),不对称,PCR,(7),锚定,PCR,(8),着色互补试验或荧光,PCR,(9),双温,PCR,(two-temperature PCR),(10),原位,PCR,（,in situ PCR, ISPCR,）,技术,90,年,Hasse,首次创建,概念,在细胞,(,爬片,甩片,涂片,),组织切片,(,冰,冻,/,石蜡,),直接对核酸进行扩增，通过掺入标记基,团直接显色或结合原位杂交进行检测的,方法,既能在组织原位检测单复制的特定,DNA/RNA,又能使扩增的特定的,DNA/RNA,片段在组织切片中,定位,特点,1. PCR,特异性高敏感性,又有原位杂交样的定位准确性,2.,能检测低于,2,个拷贝量的细胞内特定的,DNA,序,列,3.,有助于细胞内特定核酸序列定位与其形态学变化的,结 合分析,基本方法,A.,细胞或组织切片上滴加,PCR,反应液,B.,把载玻片放入热循环仪（原位,PCR,仪）中进行扩增,C.,进行原位 扩增产物检测,分类,A.,直接法原位,PCR,( direct in situ PCR),基本原理,对三磷酸核苷酸或引物进行标记,使扩增产物直接携带标记分子,据标记物性质进行产物的检测,标记物,最常用的有三种,放射性同位素,生物素,地高辛,特点,操作简便,特异性较差,易出现假阳性,扩增效率低,应用注意事项,a.,不能用于切片标本,b.,不适用于研究内源性基因重排和染色体,易位,B,间接原位,PCR,(indirect in situ ,PCR),基本原理,同常规,PCR,不带任何标记物,再利用原位杂交方法加以检测,主要步骤,标本固定,保持原有组织细胞的形态结构,渗入,使引物 核苷酸和酶等反应液进入细胞,内,(,如用酶进行消化,),原位扩增,通过原位,PCR,技术（原位,PCR,仪）,增加靶核酸序列的数量，以达到可,检测的水平,原位杂交检测,用特异性探针检测产物,特点,步骤虽然较多，但扩增效率高，特异,性较直接法强,在原位,PCR,中常用的原位杂交标记物,非同位素标记物,如 生物素 地高辛等,C,原位反转录,PCR,(in situ reverse transcription ,PCR),又称为,in situ RT-PCR,结合反转录反应（以,mRNA,为模板合成,cDNA,）,和,PCR,扩增检测细胞内低复制,mRNA,的方法,基本原理,它由,mRNA,经逆转录反应产生,cDNA,链（即在,逆转录酶的催化下，以,mRNA,为模板合成,cDNA,）,再以,cDNA,为模板，用,PCR,对靶序列进行扩增,扩增结束后，再用特异性的探针进行原位杂交,整个反应过程均在固定的组织或细胞标本上进行,标本要用,DNA,酶处理,原位,PCR,的应用,1),检测内源性基因,固有基因的检测,异常或变异基因,2),外源性基因的检测,感染基因,病毒基因,细菌基因,导入基因,原位,PCR,应用中存在的问题及对策,敏感性,特异性,产生假阳性原因,(,直接法,),错配 核苷酸错误,掺入 受损,DNA,修复,;,扩增产物弥散,对策,热启动 减少弥散,复杂性,定量分析,目前还停留在相对定量或半定量水平,(11),免疫聚合酶链反应,（,immuno,polymerase chain reaction,immuno,-PCR,简称免疫,PCR,）,技术,由,Sano,等于,1992,年首建,基本原理,单克隆抗体进行生物素化,核苷酸（,DNA,）,也生物素化,用亲和素或链霉亲和素将两者连接,构成具有双功能的嵌合分子,单抗,-,生物素,-,中介分子,-,生物素,-DNA,(,亲和素,),与抗原结合,PCR,扩增,抗体端可以与抗原结合，特异性地捕获待测抗,原，以保证检测结果的特异性，核酸（,DNA,）,端则可用引物对其进行扩增，通过对扩增产物,的检测，间接证明抗原的存在。,产物可用琼脂糖电泳检测,采用不同大小标准的,DNA,进行标记，进行电泳,检测，则可同时检出不同的抗原分子。,(12),原位免疫,PCR,（,in situ,immuno,-PCR , IS-PCR,）,技术,基本原理,中介分子同时 与,DNA,和抗体分子特异结合,其 一端连接,DNA,（,DNA,作为标记物）,另一端连接抗原,-,抗体复合物,形成一个抗原,-,抗体,-DNA,连接物,作为标记物的,DNA,分子用原位,PCR,扩增，检,测特异的,PCR,产物，即可间接地证明抗原的,存在,中介分子,链酶亲和素（,SA,）,-,蛋白,A,嵌合体,(,三,),用引物介导的原位标记,（,primed in situ,labelling, PRINS,）,技术,用于细胞或染色体原位检测特异性,DNA/RNA,基本原理,PCR,和,FISH,技术的结合,dUTP,（,用荧光素如,FITC,标记）和,dATP,dCTP,dGTP,掺入延伸的,DNA,中，使新合成,的,DNA,带有荧光素,用荧光显微镜检测,地高辛标记再用免疫细胞化学显色普通光学显微镜检测,特点及应用前景,1.,快速，简便也适用于组织切片,2.,敏感性和特异性较高,.,3.,具有很高的快速性,4.,地高辛标记， 适用于普通显微镜观察，,避免了标本荧光素标记褪色快的缺点,5.,不需使用,DNA,或,cDNA,探针，只需要特异,性引物序列，合成简便,(,四,),基因重组技术,基因重组是基因克隆的关键技术。,其基本内容包括,分离纯化或人工合成,DNA,制备,DNA,重组体,转化宿主细胞,筛选表达重组,DNA,的宿主细胞使其扩增,鉴定目的基因的正确连接及表达,主要目的是获得某一基因或,DNA,片段的大量拷贝,目的基因的获得,通常所需要的目的基因都是一些已有相关基础研究的基因,常用方法,1.PCR,扩增目的基因,2.,从基因组文库或,cDNA,文库中获得目的基因,3.,人工合成目的基因,DNA,体外重组,载体,常用的有,质粒载体,最常用的是,pBR322,噬菌体,（,phage,）,载体 最常用的为,DNA,及其衍生物,重组,DNA,转化宿主细胞,重组体克隆的筛选与鉴定,酶切、电泳、杂,交等方法,(,五,),基因转染,（,gene,transfection,）,技术,将纯化的含有靶基因的质粒,DNA,送入细胞内，并在,细胞内表达的技术,方法有,磷酸钙介导的转染法,DEAE,葡聚糖介导转染法,脂质体介导转染法,电击基因转染法,二,.,肿瘤研究中常用的分子生物学技术,(,一,),基因扩增的检测,1.,原位杂交 （,ISH,）,2.,荧光原位杂交 （,FISH,）,3.Southern blot (DNA,杂交,),4.Northern blot (RNA,杂交,),5.,原位,PCR,6.RT_PCR,(,二,),基因突变的检测,突变的几种形式,点突变 基因特定位置发生一个核苷酸的改变,基因缺失,基因易位或重排,其他：插入 甲基化 染色体非组蛋白改变等,突变的检测方法,1.,聚合酶链反应,-,单链构象多态性分析,（,Single strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products ,PCR-SSCP,）,长度相同，但碱基序列不同的单链,DNA,构象,不同,在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，,迁移率（泳动率）不同,基本方法,作,PCR,将产物变性而成为单链,进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,显示结果,可用同位素,/,荧光素标记,电泳后用相应方法,检测,(,标记在,PCR,时进行,),非同位素标记,电泳后银染显色,。,特点,PCR-SSCP,能有效的检出单个碱基置换点,突变,对短片段灵敏度高,方法简便，快速，适用于大量样本突变的,筛选，但其不能测定突变的准确位点,2.PCR-,限制性片段长度多态性,（,restrection,fragment length polymorphisms , RFLP,）,分析技术,PCR,技术扩增出来的,DNA,片段用限制性内切酶消化，,检测其酶切片段长度的差异,基本原理,序列中一个碱基发生改变，往往会改变某些,限制性内切酶的识别位点，使原来的酶切位点消失或产,生新的酶切位点,3.,变性梯度凝胶电泳法,（,denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE),基本原理,当双链,DNA,在变性梯度凝胶中进行到与,DNA,变性温度一致的凝胶位置时，,DNA,发生部分解链，电泳迁移率下降,当解链的,DNA,链中有一个碱基改变时，会在不同的时间发生解链,4. DNA,芯片技术（,DNA chip,）,检测基因突变的基本原理,集成电路 计算机 激光共聚焦,荧光标记探针,DNA,合成,6.,染色体原位杂交,（,in situ hybridization of chromosome,）,FISH (,荧光原位杂交,),PRINS,7,DNA,序列分析,（,DNA sequencing,）,（,三）肿瘤的微卫星不稳定性分析,微卫星不稳定性（,microsatellite,instability , MI,）,是指简单重复序列的增加或丢失,小卫星,DNA,（,minisatellite,DNA,）,微卫星,DNA (,microsatellite,DNA),检测方法,PCR + DNA,序列凝胶电泳,（四）肿瘤易感性检测,遗传癌症综合征与易感性,癌症综合征 易感基因,视网膜母细胞瘤,Rb1,Wilms,瘤,WT1,Li-,Fraumeni,综合征,p53,家族性腺瘤性息肉（,FAP,）,APC,遗传性非息肉性结肠癌（,HNPCC,）,hMSH2, hMSH1,乳腺癌,BRCA1,卵巢癌,BRCA1,采用相应基因变异方法进行检测,（五）肿瘤相关病毒,核酸杂交技术与,PCR,技术,