图位克隆的基本原理和方法

单击此处可编辑母版标题样式,单击此处可编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,图位克隆的基本原理和方法,何宗顺,2011.12.7,图位克隆的基本原理,其基本的原理是,：,功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座，通过找到与目标性状紧密连锁的分子标记，在利用分子标记技术对目的基因精细定位的基础上，由于水稻全基因组序列的发布，我们可以得到已定位区段的候选基因，通过对候选基因进行分析，确定目标基因，最后经遗传转化试验证实目的基因功能。,图位克隆的步骤：,Primary mapping,Fine mapping,Candidate gene,Complementation test,Functional analysis,Primary mapping,Trait,method,Mapping,population,Qualitative traits,bulked segregment analysis,F2,、,BC1,Quantitative traits,whole-genome QTL screen,RIL,、,DH,、,NIL,primary mapping method and Mapping population,作图群体,将纯合突变体与,ZS97,进行杂交，对杂交的种子进行基因型鉴定，找到杂合型种子（即种子能够发生分离），将杂合,F1,代种子种下去后就能得到,F2,代群体。,R,/R,r/r,R/R,R/r,F2,R/r,r/r,F1,P1,纯合突变体,P2,ZS97,primary mapping method,Bulked Segregment Analysis,：群组分离分析法。原理是将分离群体,(F,2,、,BC1,等,),中的个体依据研究的目标性状,(,如抗病、感病,),分成两组，每一组取样,8-15,份，在每一组群体中将各个体,DNA,等量（等浓度等体积）混合，形成两个,DNA,池,(,如抗病池和感病池,),。同时需要构建两个亲本（,ZH11/ZS97,）的,BSA,池。由于分组时仅对目标性状进行选择，因此两个池间,理论上,就应主要在目标基因区段存在差异。,ZH11,ZS97,HL15(W),HL15(M),HY1(W),HY1(M),HY2(W),HY2(M),HY3(W),HY3(M),HY5(W),HY5(M),ZH11,ZS97,HL15(W),HL15(M),ZH11,ZS97,HL15(W),HL15(M),将构建的,BSA,池分别用本室的,255,对在亲本,ZH11/ZS97,间存在多态性的,SSR,标记进行,PCR,扩增，经过跑,PAGE,胶找到与目标性状紧密连锁的标记。,找到紧密连锁的分子标记之后我们就要进行一个“阳性”检测：即检测这个找到的分子标记是不是真正的与目标性状连锁。,我们对,F2,代群体中随机选取一个,200,左右的小群体，将找到的分子标记分别扩增这些样，看表型与基因型是否对应。,同时我们可以用这个小群体进行一个初步的基因定位。,Fine mapping,一,.,表型观察,二,.,筛选交换单株,三,.,开发新的分子标记,R,/R,r/r,R/R,R/r,F2,R/r,r/r,F1,P1,纯合突变体,P2,ZS97,正常表型,突变表型,ZH11,：“,A,”,ZS97,：“,B,”交换有两种带型：,H,和,B,单株,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10,M1,M2,M3,M4,M5,H,A A,B,H,A A A A,B,H,A A,B,A A A A A A,A A A A A A A A A A,A,H,A A A,B,H H,A A,A,H H,A A,B,B,H,B,A,基因和表型相对应！,开发新的标记：,新的,SSR,标记：,http:/ gene,将最后精细定位区段在,http:/rice.plantbiology.msu.edu/cgi-bin/gbrowse/rice/,中输入定位区间的物理位置，即可显示出候选基因。,精细定位,扩大群体，进行精细定位,找到候选基因后可对候选基因进行分析以排除非目标基因，可以通过比较扩增，测序，表达量检测及,目标性状相关的生化和生理途径,等方法来排除。当然最后要说明问题的话就是构建互补载体做一个互补验证。,Complementation test,