免疫金银及铁标记技术--课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,ppt课件,*,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第六章,免疫金银及铁标记技术,1,ppt课件,免疫金技术发展简史,1971,年 胶体金应用于免疫组化,1978,年免疫金技术检测,B,淋巴细胞表面抗原,1981,年免疫金银法,1986,年彩色免疫金银法,2,ppt课件,免疫胶体金银技术,一、免疫金技术,二、免疫金银法,三、彩色免疫金银法,四、免疫金和免疫金银法的优点,五、免疫金银法染色中常见的问题及对策,六、免疫胶体铁技术,3,ppt课件,一、免疫金技术,胶体金：,金的水溶液，具有一般溶胶特性。,胶体金制备：,化学还原法；在一定浓度的金溶液中加入一定量的还原剂使金离子变成金原子（,氯金酸在还原剂作用下，聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态）。,胶体金颜色：,用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。,5-20nm,葡萄酒红,20-40nm,深红色,60nm,橙黄色,还原剂：,白磷、乙醇、过氧化氢、枸橼酸钠、鞣酸等,胶体金标记：,实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。胶体金颗粒与蛋白质因静电吸附而形成牢固结合。此外，还可与葡萄球菌蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽缀合物等非共价结合。,4,ppt课件,(2),试剂,容器,:,酸处理洗净,配制试剂,:,双蒸馏水或三蒸馏水,氯化金水溶液的配制：,1g,的氯化金溶解于双蒸水中配成,l,的水溶液；,4,冰箱内保存。,白磷配制：,在双蒸水中切块，吸干水分；放入乙醚至溶解，棕色瓶密闭保存,不需硅化处理可直接制备胶体金。,为了减少了金颗粒的吸附作用，也可用已制备的同等大小颗粒的胶体金溶液包被玻璃器皿表面，弃去，再用双蒸水洗净,。,流水冲洗；清洁液浸泡,24h,；自来水洗净清洁液；洗洁剂洗,3,4,次；自来水冲洗；蒸馏水洗,3,4,次；双蒸水把每个器皿洗,3,4,次；烤箱干燥后备用。,1,制备胶体金的准备,（,1,）玻璃器皿的清洁,5,ppt课件,2,胶体金的制备,白磷还原法、抗坏血酸还原法、,柠檬酸三钠还原法、柠檬酸钠,鞣酸还原法、,乙醇超声波还原法、硼氢化钠还原法、放射性胶体金制备法,常用的方法,:2,种,(1),柠檬酸三钠还原法,制备程序很简单，胶体金的颗粒大小较一致，广为采用。,制备胶体金时金颗粒的大小与柠檬酸三钠用量成反比。,操作步骤：,1,）,1ml,l,氯化金加入,100ml,蒸馏水中，煮沸。,2,）迅速加入,4mll,柠檬酸钠，保持沸腾状态，搅动至出现透明的橙红色。,3,）自来水冲洗烧瓶，冷却。,6,ppt课件,(2),柠檬酸钠,鞣酸还原法,特点：,通过改变鞣酸的用量制备出多种颗粒直径的胶体金，,且颗粒的直径均匀一致，适合于双标及多标研究。,操作步骤：,1,）根据所需的胶体金颗粒分别配制,A,液和,B,液。,2,）将配制好的,A,、,B,两液在水浴内加热到,60,，保持温度稳定。,3,）在电磁搅拌器上搅拌,A,液迅速加入,B,液，加热,7,10min,至胶体,金变成葡萄酒色。,4),用自来水冲洗烧瓶，使之迅速冷却。,原理：,柠檬酸三钠,主要为还原剂。,鞣酸,还原、保护作用，决定胶体金颗粒大小形成,。,7,ppt课件,制备胶体金时都应注意以下各点：,所有溶液均应用双蒸水配制,柠檬酸钠与鞣酸溶液应现用现配,用于制备胶体金的烧瓶硅化需处理,在清洁干燥的烧瓶中加入少许,1,硅油，轻轻转动烧瓶，,使硅油均匀铺展于烧瓶内壁，倾出多余硅油。,烧瓶置烤箱内烘干。,上述步骤可重复,2,3,次,8,ppt课件,3,蛋白质的胶体金标记,原理：,PH,值等于或稍偏碱性的蛋白质等电点时，蛋白质呈,中性,，此时蛋白质分子与胶体金颗粒相互间的静电作用较小，但蛋白质表面张力最大，处于微弱的水化状态，能牢固,吸附,于金颗粒表面，形成蛋白层，阻止胶体金颗粒相互接触，而使胶体金处于,稳定,状态；,PH,值高于蛋白质等电点时，蛋白质带,负电荷,，与胶体金颗粒负电荷相互,排斥,不能结合。,稳定剂：,牛血清白蛋白、卵白蛋白、聚乙二醇、明胶,9,ppt课件,（,1,）待标记蛋白质准备,透析除盐,除去蛋白质内多余电解质，过高的盐类物质会降低胶体金颗粒的电位，影,响蛋白质吸附。,方法,:,蛋白质置于透析袋直接放入双蒸水或极低浓度盐水透析,去除蛋白沉淀,低温保存的蛋白质或抗体易形成聚合物，聚合物对标记过程及免疫金探针,的稳定性有影响，标记前离心除去聚合物。,待标记蛋白质最适稳定量的测定,光电比色法、目测法,（,2,）胶体金,PH,值调整,标记前将胶体金溶液的,PH,值调至待标记蛋白质的等电点略偏碱,10,ppt课件,（,3,）蛋白质的胶体金标记,（,1,）根据标记胶体金的总量计算所需待标记蛋白质的总量。,（,2,）在电磁搅拌下，将蛋白质溶液加入胶体金溶液中（,pH,已调至,PI,超过,0.5pH,），逐滴加入蛋白质，,1mg,的蛋白质大约,5min,加完。,（,3,）加入,5%,的牛血清白蛋白使其终浓度为,1%,，或加入,3%,聚乙二醇使其终浓度为,0.05%,前者,稳定胶体金的效果好于后者。,（,4,）将标记好的胶体金装入透析袋，扎紧，放入蔗糖或硅胶中浓缩到原体积的,1/10,量，后纯化。,离心法纯化时，不要浓缩。,11,ppt课件,（,4,）,胶体金标记蛋白质的纯化,目的：,除去未标记蛋白、未标价胶体金、聚合物。,方法：,高速与超速离心法、凝胶过滤法,1,）高速与超速离心法,1,）将标记的大于,10nm,的胶体金溶液,高速,离心机离心,15min,，吸上清，弃沉淀，去除大的聚合物。,2,）小于,10nm,颗粒的胶体金用,超速,离心机离心，在,4,离心,1h,左右，弃上清，将沉淀以,TBS,溶解，重复离心,2,3,次，沉淀溶于,TBS,中。,4,保存备用。,为了得到颗粒均匀一致的免疫金试剂，上述粗提制剂可用,10,-,30%,蔗糖或甘油溶液作密度梯度离心，分带收集。,12,ppt课件,2),凝胶过滤法,特点：,简便，颗粒比较均匀，,不易凝集，克服了离心,方法胶体金颗粒易凝集,的弱点。必须用牛血清,白蛋白作稳定剂。,操作过程：,1,）浓缩的胶体金离心取上清,2,）加样体积为柱状体积的,1/10,3),丙烯葡萄糖,S-400,装柱，,TBS,平,衡层析柱,4,）,TBS,洗脱，注意颜色变化。,13,ppt课件,（,5,）,免疫金染色法,1978,年，首次应用免疫金探针检测,B,淋巴细胞表面抗原，建立了用于光镜水平的,免疫金法（,IGS,）。,特点：,染色程序简便，不要显色,;,能检测细胞表面和细胞内抗原。,要求,:,金颗粒的直径大于,20nm,，且浓度较高。,一般都采用间接法。,14,ppt课件,（,1,）石蜡切片,脱蜡至水。,（,2,）胰蛋白酶消化或尿素消化。,（,3,）用双蒸水振洗,5,2,。,（,4,）用,0.02mol/l TBS pH8.2,振洗,10,2,。,（,5,）,1%,卵蛋白（,EA,）封闭,10min,。,（,6,）稀释,鼠抗,HBsAg,单克隆抗体,（,TBS,），,4,过夜。,（,7,）,0.02mol/l TBSpH8.2,振洗,10,2,。,（,8,）,1%EA,封闭,10min,。,IGS,的步骤（人肝组织,HBsAg,的定位为例,),：,（,9,）,TBS,稀释,兔抗鼠金标抗体。,（,10,）,TBS,振洗,.,（,11,）双蒸水振洗,5,2,。,（,12,）,1%,戊二醛，,10min,。,（,13,）双蒸水,5min,。,（,14,）用苏木素衬染核，甘油封片。,结果：,光镜下部分肝细胞浆内有金颗粒聚集呈红色，,表明有,HBsAg,定位在细胞浆内。,15,ppt课件,(,6),蛋白,A-,金（,PAG,）放大法,在,IGS,方法定位细胞抗原时可用搭桥法，使,IGS,得到放大,.,抗,A,蛋白抗体作桥的,PAG,放大法,(,以,5-,羟色胺定位为例,):,（,1,）石蜡切片,脱蜡至水。,（,2,）胰蛋白酶消化或尿素消化。,（,3,）,TBS,洗,5,2,。,（,4,）,1%EA,封闭组织。,（,5,）用,TBS,稀释,兔抗,5-,羟色胺抗体,4,过夜，或者,371h,。,（,6,）,TBS,振洗,5,2,。,16,ppt课件,（,7,）,1%EA,封闭,10min,。,（,8,）用,0.05mol/l pH7.4 TBS,稀释,PAG,.,（,9,）,0.05mol/l pH7.4 TBS,振洗,10,2,。,（,10,）,1%EA,封闭,10min,。,（,11,）,抗,A,蛋白抗体,（,1,：,100,）,3745min,。,（,12,）,0.05mol/l pH7.4 tbs,振洗,10,2,。,（,13,）加,0.05mol/l pH7.4 TBS,稀释,PAG,（,1,：,40,）。,（,14,）,0.05mol/l pH7.4 TBS,振洗,10,2,。,（,15,）双蒸水振洗,5min,。,（,16,）,1%,戊二醛,10min,。,（,17,）双蒸水振洗,5min,。,（,18,）,0.01%,伊文思蓝,2min,，甘油封片。,17,ppt课件,结果：,光镜下观察，小肠粘膜内含有嗜银颗粒的细胞胞浆呈红色，阳性颗粒位于细胞核底部，比单纯用,PAG,染色深度得到加深，阳性结果得到放大。,原理：,抗,A,蛋白抗体,Fab,段、,Fc,段均可与,PAG,上的,A,蛋白结合，因此，聚集更多的胶体金颗粒。,PAG,放大法的优点：,使用试剂单一；,敏感性高；,背景干净。,18,ppt课件,二、免疫金银法（,IGSS,）,原理,:,将,1GS,与银显影方法相结合,沉积在抗原位置的胶体金颗粒起着催化剂的作用，使显影液中的银离子在还原剂,(,对苯二酚,),存在的情况下被还原为银原子，在金颗粒周围形成一个,“,银壳,”,，由于金颗粒的液化作用，使更多的银离子被还原，,“,银壳,”,增大，最后使抗原位置得以放大。,19,ppt课件,1,硝酸银显影液的配制,(1)10,明胶液,+,枸橼酸缓冲液,+,对苯二酚,+,蒸馏水，,混合，磁力搅拌均匀,(,注意避光,),，用前加入硝酸银水溶液,(2)Ph,3.5,枸橼酸缓冲液：枸橼酸,+,枸橼酸三钠,+,双蒸水,2,操作步骤,(1),组织固定后，,5,、,10,和,20,系列浓度的蔗糖处理，制作冰冻切片，厚,10,30gm,；,(2),含,l,正常羊血清或,1,BSA,的,PBS,室温孵育,20,分钟，封闭抗体非特异性结合部位；,(3),含,1,氢硼化钠的,PBS,孵育,20,分钟；,(4),第一抗体,孵育，可先置,4,度，,12,18,小时，然后室温,1,小时，使抗体充分渗透并结合；,20,ppt课件,(5)PBS,漂洗,3,次，每次,5,分钟；,(6)0.1,BSA,PBS,液,(pH 8,2),漂洗,5,分钟，为胶体金结合提供碱性环境；,(7),胶体金标记的第二抗体,(pH 8.2),室温孵育,30,45,分钟，摸索最佳稀释,(8),硝酸银液避光处理,2,10,分钟，显影时间最好根据实验结果确定；,(9),解剖显微镜下选取免疫反应阳性部位。,1,Os04,后固定,30,分钟，双蒸水漂洗；,(10),组织标本的脱水、树脂包埋、超薄切片制作及电镜观察等方法同前述。,结果：,光镜下见阳性黑色状颗粒，背景干净。,21,ppt课件,5nm SPA,胶体金电镜观察,SPA,胶体金标记,I,型单纯疱疹病毒,(HSV-1),抗原免疫电镜,人胚肺细胞,细胞膜结构完整，细胞浆中病毒囊膜及其邻近的内质网膜上的病毒抗原结合，在未成熟的病毒囊膜上也有大量的金颗粒，他们的外周区域可见大量的金颗粒聚集,22,ppt课件,三、彩色免疫金银法（,CIGSS,）,基本原理：,是在,IGSS,基础上发展起来的新方法，与彩色显影相似。,IGSS,方法染