流式细胞术(下)课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2016/4/25 Monday,#,流式细胞术,之,流式细胞仪的应用,韦俊,2013.09,技术,专题,流式细胞术之流式细胞仪的应用韦俊技术专题,目录,染料选择,样本设置,样本制备,数据分析,目录染料选择,荧光染料的选择,必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发,激发的光谱必须在仪器上滤光片能够接受的合适范围内,荧光素光谱的重叠应当尽量减少,荧光染料的选择必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发,免疫荧光标记,荧光染料与细胞成分的四种结合方式,结构,亲和,式（,DAPI,）,嵌入结合（,PI,，,EB,）,共价键,结合,荧光标记,抗体特异性结合,免疫荧光标记方法,直标,:,干扰少,但需购买多种单抗,间标,:,步骤多,干扰多,不需标记多种抗体,免疫荧光标记荧光染料与细胞成分的四种结合方式,荧光染料,激发,波长 (,nm),发射波长(,nm),激光谱线,(,nm),备注,DAPI 359 461 UV,A T,特异性,Hoechst33342 346 460 UV,A,T,特异性,Hoechst33258 346 460 UV,A T,特异性,PI 536 617 488,不能进入活细胞,EGFP,489 508 488/458,增强,绿色荧光蛋白,Ds Red,558 583,568/514/488,红色荧光蛋白,FITC,494 518 488,对,pH,敏感,荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm),样本的设置,阴性对照：,作用是调节各荧光探测器合适的放大倍数，将仪器归零，即确定待测标本的基础荧光阈值,。,阳性,对照：,通常用于检测抗体是否有问题或确定实验方法的稳定性、准确性。,空白对照：,即不进行标记的细胞，用于确定待测标本的基础荧光阈值或检测方法是否成功。,补偿,对照：,由于荧光光谱的重叠，对于多色分析样本必须设置补偿对照，用于补偿调节。将多色标记的各荧光抗体一一进行单色标记。,样本的设置阴性对照：作用是调节各荧光探测器合适的放大倍数，将,荧光补偿调节,补偿前,补偿后,荧光补偿调节补偿前补偿后,样本的制备,单细胞悬液的制备,目的,分子标记,样本,过滤等待上机,单细胞悬液,样本的制备单细胞悬液的制备单细胞悬液,培养细胞的样品制备,吸除培养上清液，用,PBS,漂洗一次,将,培养细胞用,0.04% EDTA-2Na,或,0.29%,胰蛋白酶消化,3-7,min,，至,光镜下见到贴壁细胞间出现筛状间隙为止，弃去消化液，,加,PBS,液,用,吸管将细胞从瓶壁上轻轻吹打,下来（尽量避免产生泡沫），,并移入离心管,中，短,时低速离心，即,800-1000r/min,，,5min,弃,上清，加,pH7.4,的,PBS,液，,低速短时离心,，,800-1000r/min,离心,3-5min,，重复,2-3,次，以去除细胞悬液中的,细胞碎片,加,少许,PBS,液，将沉淀细胞轻轻吹打均匀，加固定液或低温,保存,备用,培养细胞的样品制备吸除培养上清液，用PBS漂洗一次,流式分析样本的制备,单细胞悬液的制备,目的分子标记：最好选用直标抗体，即抗体,-,荧光素，标记后用,PBS,洗,2-3,次。,样本过滤等待上机：标记好的单细胞样本重悬至,10,6,个,/,毫升,、,300-500,微升的总体积，再,用,300,目的滤网过滤至,5,毫升,流式,管中等待上机。也可用,1-2%,的多聚甲醛等固定，,24,小时,内上机测试。,流式分析样本的制备单细胞悬液的制备,流式分选样本的制备,样本制备的所有过程要在细胞培养间完成,样本制备过程中所需试剂均需做无菌处理：如胰酶、抗体类需用,milipore,的,0.2um,滤器过滤，,PBS,等缓冲液需高压灭菌，所有器械、容器均需高压灭菌等。,样本制备完毕后需用无菌,PBS,重悬至,10,7,10,8,个,/,毫升，用,400,目筛网（经过高压灭菌处理）过滤至,5,毫升无菌流式管中密封后准备上机。娇气的细胞可加入,2%,的血清保持细胞活性。,样本收集管可采用,5,毫升无菌流式管、,15,毫升离心管、,696,孔板等。为了保持细胞活性，收集容器中可加入适量纯血清或完全培养基等备用。,制备好的样本及收集容器密封好后最好放在冰盒上待用。,流式分选样本的制备样本制备的所有过程要在细胞培养间完成,数据分析,参数：,FS,SS,FL,数据显示方式,设,门分析技术,数据分析参数：FS,SS,FL,参 数 说 明,FS,：反映颗粒的大小,SS,：反映颗粒的内部结构复杂程度,FL,：反映颗粒被染上的荧光数量多少,参 数 说 明FS：反映颗粒的大小,数 据 显 示 方 式,单参数直方图,双参数直方图,:,点图,二,维等高图,假三维等高图,三参数直方图,多参数分析,数 据 显 示 方 式单参数直方图,单参数直方图,每一个细胞单参数的测量数据可整理成分布统计，以分布直方图,(distribution histogram),来显示。在图中，横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度的值，其单位是道数，横坐标可以是线性的，也可以是对数的，纵坐标一般是细胞数,DNA,含量直方图和抗原表达直方图,单参数直方图每一个细胞单参数的测量数据可整理成分布统计，以分,二维散点图,双色荧光标记细胞散点图,外周全血细胞散射光双参数点图,二维散点图双色荧光标记细胞散点图外周全血细胞散射光双参数点图,等高图与密度图,等高图,等高图与密度图等高图,假三维图,三维图,假三维图三维图,设 门 分 析 技 术,Gate,设置：指,根据细胞分布图中的细胞,群分布选定其中想要分析的特定细胞,群，并对其进行单参数或多参数分析。,根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字门。,设 门 分 析 技 术Gate设置：指根据细胞分布图中的细胞,线性门,线性门,线性门线性门,任意门,A,淋巴细胞,B,单核细胞,C,中性粒细胞,D Hepa1-6,细胞,ABCD,均为任意门,D,任意门A 淋巴细胞D,十字门,全图划分为四个,象限,：,左下,象限（,LL）,为双阴性细胞,，,左,上象限（,UL）,为,Y,轴阳性细胞,（,GFP+），,右,下象限（,LR）,为,X,轴阳性细胞,（,PI+），,右,上,象限（,UR,）,为双阳性细胞,（,GFP,+/PI+）。,十字门全图划分为四个象限：,双阳性,细胞,（,GFP+/PI,+）,的,百分含量为：,2,0,/,6765,=,0.3,%,双阳性细胞（GFP+/PI+）的百分含量为：20/6765=,THANK,S,THANKS,