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LOGO,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,Page,*,单击此处编辑母版标题样式,Your company slogan in here,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,*,*,Click to edit Master title style,Your company slogan in here,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,*,*,Click to edit Master title style,Your company slogan in here,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,*,*,Click to edit Master title style,厌氧微生物的探讨方法与技术,单击此处添加标题文字,市政工程：,16s rRNA基因技术在油藏微生物探讨的应用,分子生态学探讨方法,2,3,4,书目：,传统探讨方法,厌氧微生物介绍,1,1.厌氧微生物的定义：,厌氧微生物尚无公认的精确定义，但通常认为这是一类只能在低氧分压的条件下生长，而不能在空气（18%氧气）和（或）10二氧化碳浓度下的固体培育基表面生长的微生物。,第一章、厌氧微生物介绍,严格厌氧微生物：氧气对其有毒性,厌氧微生物,兼性厌氧微生物：有氧无氧条件下都可生存。,第一章、厌氧微生物介绍,2.几种厌氧微生物的图片：,1.厌氧微生物探讨方法背景：,厌氧微生物是整个微生物世界的一个重要组成部分。但由于厌氧微生物难于培育其相关的技术始终未得到很好的开发利用，但随着近二十多年随着厌氧操作技术的不断完善，厌氧微生物探讨方法的不断改进，尤其近十多年来很多新技术和方法的应用，致使厌氧微生物学取得很大的进展，获得了丰硕的成果。,其次章、厌氧微生物的传统探讨方法,2、常见的几种传统探讨技术与方法：,其次章、厌氧微生物的传统探讨方法,一般厌氧技术,严格厌氧技术,厌氧微生物传统研究技术与方法,其他厌氧技术,其次章、厌氧微生物的传统探讨方法,2.1一般厌氧技术：,厌氧袋,厌氧罐,一般厌氧技术,其次章、厌氧微生物的传统探讨方法,2.1.1厌氧袋技术：,依据氢“燃烧”除氧的原理所设计的一种简易厌氧袋，不但适用于培育各种临床标本中的厌氧菌，也适合培育其他专性厌氧菌。,其次章、厌氧微生物的传统探讨方法,2.1.1.1厌氧袋技术原理：,利用氢硼化钠(NaBH4)或氢硼化钾(KBH4)与水反应产生氢，氢与密封袋中的氧气在把催化下结合成水，从而建立起无氧小环境。,1,厌氧袋中二氧化碳由下列反应供应:,柠檬酸+3NaH003一柠檬酸钠+3H2O+3CO2,2,利用美蓝的变色反应作为厌氧度的指示剂。厌氧环境则指示剂呈无色，有O,2,则变为蓝色。也有用刃天青指示剂。,3,其次章、厌氧微生物的传统探讨方法,2.1.2厌氧罐技术：,厌氧罐的商品名为Jar，一种小型的培育厌氧菌的密封容器。国外的名牌有“Gaspak”、“Tobal”、“BTL”、“Don whitley”等厌氧罐。使厌氧罐达到无氧状态有多种方法，例如，用抽气换气法以氮或二氧化碳驱除罐内氧气;在各种不同的除氧方法中，获得最快速发展和广泛运用的是利用含把(或铂)的常温催化剂使氢与氧发生“燃烧”以达到除氧的方法。,其次章、厌氧微生物的传统探讨方法,2.1.2.1厌氧罐技术构造：,罐体,目前最广泛运用的厌氧罐体都是接受,透亮的聚碳酸醋硬质塑料制成。常见的规格是内径,为15Cm，高25cm的圆筒形罐体，其内可放直径gcm,培育皿10只;在盖的下方中心，旋连着一个金属丝,网盒，用于存放活化的钯粒,H2和CO2的供应,厌氧罐供氢和CO2有内源法和外源法两种。内源法相像于厌氧袋。外源,法抽气换气程序为:抽气-换气一再抽气一充N2一CO2一H2,催化剂和,厌氧指示剂,一般用常温下即可起催化的“冷式”催化剂，如“钯粒”等，它是由含钯的,石棉等填充料加工而成的。每次运用前，把催化剂,都应在140一160烘箱内烘2h活化。指示剂为美蓝。,其次章、厌氧微生物的传统探讨方法,2.1.2.2厌氧罐技术优缺点：,缺点：,优点：,1、没有厌氧分别操作系统。,2、对厌氧菌进行恒温厌氧培育时，要将厌氧罐放置到另一个恒温培育箱(不,如BugBox等厌氧工作站便利，能二者兼顾)。,3、对厌氧菌培育的好坏不易视察。,4、因为将密封系统启开取出视察，势必造成厌氧环境被破坏。,1、目前已广泛运用在医院啤酒厂等场所。,2、敏捷、简洁。,3、与厌氧袋对比，某些厌氧罐法也接受外源H2和CO2，相对而言便利、省时，易操作。,其次章、厌氧微生物的传统探讨方法,2.2严格厌氧技术：,有区分于一般厌氧技术，为了培育严格厌氧微生物而开发的严格厌氧技术,对厌氧环境要求更为严格。其所能供应的厌氧环境更为严格。,目前主要技术,厌氧手套箱法(如英国Ruskinn厌氧工作站,）,其次章、厌氧微生物的传统探讨方法,2.2.1厌氧手套箱技术：,以Ruskinn的厌氧工作站为例：,这种厌氧手套箱工作站汇合分别纯化操作、恒温培育、便利视察等传统厌氧袋或罐所不具备的功能于一体且产品的类型包括专性厌氧、微好氧和低氧(次氧)的系列培育条件，充分满足当代微生物学家及专业人士对厌氧培育应具备的功能多样化和产品系列化的综合要求。,其次章、厌氧微生物的传统探讨方法,2.2.2厌氧手套箱技术原理：,基本原理相同于传统的厌氧罐、厌氧袋，但Ruskinn的厌氧工作站作了较科学的改进，从而使其确保了比传统厌氧罐或厌氧袋更严格的厌氧环境。,1、供气系统,接受外源供气(一个单瓶供气)，气体为无氧混,合气体;也可选双气供气，即多加一个氮气瓶，这种,消耗更为经济。,2、催化剂系统,Ruskinn厌氧工作站各型号均接受特殊处理的,把催化剂，省去了每次运用后的活化步骤，该催化剂,可运用一年以上。,其次章、厌氧微生物的传统探讨方法,3、恒湿系统,Ruskim:厌氧工作站对传统厌氧罐的吸湿系统作了很大改进。如：concept400厌氧工作站在操作室顶部装了一个恒,湿器，当湿度高于设定值时，该恒湿器自动除湿;当,环境湿度低于设定值时，该装置将收集到冷凝水蒸发，以提高环境的湿度。,其次章、厌氧微生物的传统探讨方法,2.2.3厌氧手套箱技术特点：,工作容量大，工作室可放置多达550个90,mm,的培养皿，,2,可调节的高密度荧光灯和卤素观察灯，由脚动开关控制。,4,快速转移闸装置可保证在45秒内转移40多个90,mm,培养皿,3,3,符合人类环境改造学设计原理,3,1,其次章、厌氧微生物的传统探讨方法,2.2.4厌氧手套箱技术优点：,厌氧培育技术的多功能性:与传统的厌氧罐对比，厌氧工作站能在其工作箱中进行高质量的厌氧菌的分别、纯化、培育，且易视察(不用解除厌氧环境)。,快速和高质量地分别效果:通过袖式裸手操作系统和快速气闸转移系统可快速操作和分别厌氧菌。而传统厌氧罐或厌氧袋没有分别操作空间。,其次章、厌氧微生物的传统探讨方法,2.3其他厌氧技术：,1、,生物耗氧法,2、,亨盖特厌氧滚管技术,3、疱肉培育基,第三章、分子生态学探讨方法,1.分,子生态学引入背景：,（1）传统的厌氧微生物分别培育方法不能满足厌氧微生物原位识别及形态学探讨的须要,并且在多样性和动力学探讨方面还存在着严峻的局限性：,培育过程困难耗时;,只能反映显微镜条件下极少部分(10%)的菌落数。,（2）近10年发展起来的以分子生物学方法为基础的分子生态学,大大拓宽了厌氧微生物生态学的探讨视野,使之可以更客观、更干脆地探厌烦氧微生物种群结构、遗传多样性及其与环境间的相互关系。,第三章、分子生态学探讨方法,2,.分子生态学技术：,1、,核酸探针检测技术,2,、,利用引物的PCR技术,3,、,DNA序列分析,4,、基因芯片技术,第三章、分子生态学探讨方法,2,.,1,核酸探针检测技术,：,原理：,以核酸分子,杂交技术,为核心,利用探针分析DNA序列及片段长度多态性.,2.1.2探针：能与特定核苷酸序列发生特异性,互补的已知核酸片段,。,3、,PCR产物或人工合成的寡核苷酸探针,2、,从RNA制备cDNA探针,1、长探针和短探针,探针类型：,第三章、分子生态学探讨方法,2.1.3应用方向,：,（1）应用于对环境中的厌氧微生物的检测,定性、定量分析它们的存在、,分布、丰度和适应性等探讨目标。,（2）作为一种能高度灵敏检测污染环境下厌氧微生物种群变更的方法。,第三章、分子生态学探讨方法,2,.,2,利用引物的PCR技术,：,2.2.1简介：1985年,Mullis独创了聚合酶链式反应(PCR)技术,即以一对特定的寡核苷酸片段为引物,在耐热的TaqDNA聚合酶作用下,体外合成特异的DNA片段,在数小时内可将目的基因扩增上百万倍.,2.2.2意义：使得在困难环境中,对那些混合物内低含量的群体成员或微生物群中某个特异基因的检测与探讨成为可能.,PCR技术分类：,1)反转录PCR技术(RT-PCR),2）,竞争PCR(C-PCR),3）,随机扩增多态性DNA技术(RAPD),第三章、分子生态学探讨方法,2.3,DNA序列分析,技术,：,最充分揭示DNA多样性的方法是DNA序列分析.尤其是荧光标记的核酸自动测序仪的普遍运用,同时随着分子信息学的发展,已有很多功能基因及特地的rDNA序列数据库软件供序列比较,使核基因的序列分析可揭示更高水平多态性.,生态学上用的最多的是“通用”引物扩增DNA某些基因(如rDNA)的DNA片段,随后用通用引物干脆测序.,第三章、分子生态学探讨方法,2.4基因芯片技术,：,2.4.1 简介：,基因芯片(Microarray)技术于1991年首次在Science杂志上被提出,是生物芯片(Biochip)的一种。,该技术是随着人类基因组支配的逐步实施和分子生物学的迅猛发展而产生的。在短短的10多年时间里基因芯片的探讨和应用取得了巨大的进步。,基因芯片技术分类：,1、含有编码关于,不同生物化学循环过程关键酶的功,能基因芯片,。,2、含有源于核糖体核酸(rRNA)基因探针的系统发,育的寡核苷酸芯片,3、用纯培育微生物的整个DNA基因组构建的群落基因,组芯片,第三章、分子生态学探讨方法,技术优点：,与传统的多孔膜核酸杂交技术相比,玻片等为载体的基因芯片供应了更多的优点,如高密度、高灵敏度、快速实时检测、经济、自动化和低背景水同等,第四章、16s rRNA基因技术在油藏微生物探讨的应用,1.探讨背景：,（1）厌氧,微生物采油技术(MEOR)技术相对其它的3次采油技术具有,成本低,、,适用范围广,、,环境相对友好,等优点而备受重视,（2）,作为地下生物圈的组成部分,油藏微生物,（主要是厌氧微生物）,不仅在元素的生物地球化学循环过程中起着重要作用,其独特的生理生化特征及微生物产生的酶和其他代谢产物在,生物技术,上具有巨大应用潜力,第四章、16s rRNA基因技术在油藏微生物探讨的应用,2.,油藏微生物类群：,微生物类群,铁还原菌,发酵菌,硝酸盐还原菌,产甲烷古菌,等,硫酸盐还原菌,第四章、16s rRNA基因技术在油藏微生物探讨的应用,3.,技术原理：,（3)16S rRNA基因的全序列分为,可变区和恒定区,两部分,可变区序列因不同细菌而异,恒定区序列基本保守。可以利用恒定区序列扩增，利用可变区序列的差异来对不同属、种的细菌进行分类鉴定。,（2)16S rDNA分子结构上高度保守,只在某些位置有少量的核苷酸序,列变更,而且这些位置的变更有属或种特异性。其所含信息较多,长度又较适中，更适合于微生物分子生态的探讨。,（1)rRNA存在于全部的生物中,rRNA是
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