15酵母基因工程

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,第十五章 酵母基因工程,五、,酵母菌的表达系统,第十五章,酵母基因工程,三、,酵母菌的载体系统,二、,酵母菌的宿主系统,一、,酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征,六、利用重组,酵母生产乙肝疫苗,四、,酵母菌的转化系统,一、,酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征,第十五章,酵母基因工程,1,、酵母菌的分类学特征,酵母菌（,Yeast,）,是一群以,芽殖,或,裂殖,方式进行,无性繁殖,的单细,胞,真核生物,，分属于,子囊菌纲,（子囊酵母菌）、,担子菌纲,（担子酵母,菌）、,半知菌类,（,半知酵母菌,），共由,56,个属和,500,多个种组成。如,果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最,成熟的真核生物表达系统。,一、,酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征,2,、酵母菌表达外源基因的优势,全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便,能将外源基因表达产物分泌至培养基中,具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统,大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉,不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国,FDA,认定为安全的,基因工程受体系统（,Generally Recognized As Safe GRAS）,酵母菌是最简单的真核模式生物,第十五章,酵母基因工程,二、,酵母菌的宿主系统,2,、提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌,3,、抑制超糖基化作用的突变宿主菌,4,、减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌,1,、广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌,第十五章,酵母基因工程,1,、广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌,目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括：,酵母属,如,酿酒酵母,（,Saccharomyces,cerevisiae,）,克鲁维酵母属,如,乳酸克鲁维酵母,（,Kluyveromyces,lactis,）,毕赤酵母属,如,巴斯德毕赤酵母,（,Pichia,pastoris,）,裂殖酵母属,如,非洲酒裂殖酵母,（,Schizosaccharomyces,pombe,）,汉逊酵母属,如,多态汉逊酵母,（,Hansenula,polymorpha,）,其中,酿酒酵母,的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但,巴斯德毕赤酵母,表达外源基因最理想。,2,、提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌,能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型,ssc,1,改善重组蛋白分泌 钙离子依赖型的,ATP,酶,ssc,2,提高重组蛋白表达 转录后加工,rgr,1,提高重组蛋白表达 转录水平,ose,1,提高重组蛋白表达 转录水平,ssc,11,改善重组蛋白分泌 羧肽酶,Y,rho,-,提高重组蛋白表达 转录水平,突变类型,生物效应,作用位点,3,、抑制超糖基化作用的突变宿主菌,能抑制超糖基化的突变类型,mnn,甘露糖生物合成缺陷型,alg,天门冬酰胺侧链糖基化缺陷型,och,外侧糖链添加缺陷型,突变类型,生物效应,许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团，,它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由,糖基核心,和,外侧糖,链,两部分组成。,酵母菌普遍拥有蛋白,质的糖基化系统，但野生,型酿酒酵母对异源蛋白的,糖基化反应很难控制，呈,超糖基化倾向，因此超糖,基化缺陷株非常重要。,4,、减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌,（,1,）泛素、介导的蛋白质降解作用,蛋白酶体,Lys,HOOC,Ubiquitin,76,aa,ubiquitin,ligase,E3,Lys,ubiquitin,ligase,E3,Lys,靶蛋白,靶蛋白,靶蛋白,（,2,）酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因,酵母菌共有四个泛素编码基因：,UBI,1,编码,泛素-羧基延伸蛋白52,（,CEP52）,对数生长期表达 稳定期关闭,UBI,2,编码,泛素-羧基延伸蛋白52,（,CEP52）,对数生长期表达 稳定期关闭,UBI,3,编码,泛素-羧基延伸蛋白76,（,CEP76）,对数生长期表达 稳定期关闭,UBI,4,编码,泛素五聚体,对数生长期关闭 稳定期表达,酵母菌共有七个泛素连接酶基因：,UBC,1、,UBC,2、,UBC,3、,UBC,4、,UBC,5、,UBC,6、,UBC,7,（,3,）泛素降解途径衰减的酿酒酵母,在酿酒酵母菌中，泛素主要由,UBI,4,基因表达，,UBI,4,-,突变株能,UBI,4缺陷型：,正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多，,因此,UBI,4,缺陷突变株是外源基因表达理想的受体,UBA,1缺陷型：,UBA,1,编码,泛素激活酶,E1，,UBA,1突变株是致死性的，但其等位,基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解,Ubc4,-,ubc5,双突变型：,七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效,三、,酵母菌的载体系统,酵母菌克隆表达质粒的构建,酵母菌中的野生型质粒,第十五章,酵母基因工程,酵母菌中的野生型质粒,酿酒酵母中的2,m,环状质粒,几乎所有的酿酒酵母中都含有,2,m,双链,同源重组,REP1,RAF,STB,ori,REP2,FLP,IR,IR,A,B,环状质粒，拷贝数达,50,至,100,个。,IRs,反向重复序列，600,bp,，,重组,FLP,编码产物驱动,IRs,的同源重组,REP,编码产物控制质粒的稳定性,STB,REP,的结合位点,接合酵母属中的,pSR1,和,pSB1,，,以及,克鲁维酵母属中的,pKD1,等均与,2,m,质,粒类似。,酵母菌中的野生型质粒,乳酸克鲁维酵母中的线,状质粒,乳酸克鲁维酵母中含有两种不同,pGKL1 8.9 kb,DNA,聚合酶,毒素蛋白,ab,免疫蛋白,g,亚基,的双链线状质粒,pGKL1,和,pGKL1,拷贝数为,50-100,个，分别携带,K1,K2,两种能使多种酵母菌致死的毒,反向重复序列,素蛋白编码基因（,a b g,），,同时含有毒素蛋白抗性基因。,酵母菌克隆表达质粒的构建,含有,ARS,的,YRp,质粒的构建,ARS,为酵母菌中的自主复制序列，0.8-1.5,kb，,染色体上每30-40,kb,就有一个,ARS,元件。酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括,复制子,、,标,记基因,、提供克隆位点的大肠杆菌,质粒,DNA,。,以,ARS,为复制子的质粒称为,YRp,上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达,200,个，但培养几代,以,2,m,质粒上的复制元件为复制子的质粒称为,YEp,后，质粒的丢失率高达,50%-70%,，主要是由于分配不均匀所致。,酵母菌克隆表达质粒的构建,含有,CEN,的,YCp,质粒的构建,CEN,为酵母菌染色体,DNA,上与染色体均匀分配有关的序列,将,CEN,DNA,插入含,ARS,的质粒中，获得的新载体称为,YCp,YCp,质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有,1-5,个,含有,TEL,的,YAC,质粒的构建,酵母菌克隆表达质粒的构建,含有酵母菌染色体,DNA,同源序列的,YIp,质粒的构建,在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体,DNA,特定序列和标记基因，,构建出来的质粒称为,Yip,。,目的基因表达盒通常插在染色体,DNA,特定,序列中，这样目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色体,DNA,区域,四、,酵母菌的转化系统,2,、,转化质粒在酵母细胞中的命运,1,、,酵母菌的转化程序,3,、,用于转化子筛选的标记基因,第十五章,酵母基因工程,1,、酵母菌的转化程序,（,1,）酵母菌原生质体转化法,早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质体转化,法，在,Ca,2+,和,PEG,的存在下，转化细胞可达原生质体总数的,1-2%,。,但该程序操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率的严重制约,原生质体转化法的一个显著特点是，一个受体细胞可同时接纳,多个质粒分子，而且这种共转化的原生质体占转化子总数的,25-33%,1,、酵母菌的转化程序,（,2,）碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化,酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如,Li,+,等）、,PEG、,热休克,处理后，也可高效吸收质粒,DNA，,而且具有下列特性：,吸收线型,DNA,的能力明显大于环状,DNA，,两者相差80倍,共转化现象极为罕见,1,、酵母菌的转化程序,（,3,）酵母菌电击转化法,酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒,DNA，,但在此过程中应避免使用,PEG，,它对受电击的细胞具有较很大的负,作用。电击转化的优点是不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条件,适用范围广,，而且转化率可高达,10,5,/,m,g,DNA。,2,、转化质粒在酵母细胞中的命运,单双链,DNA,均可转化酵母菌，但单链的转化率是双链的10-30倍,含有复制子的单链质粒进入细胞后，能准确地转化为双链并复制,不含复制子的单链质粒进入细胞后，能高效地同源整合入染色体,这对于体内定点突变酵母基因组极为有利,克隆在,YIp,整合型质粒上的外源基因，如果含有受体细胞的染色体,DNA,的同源序列，会发生高频同源整合，整合子占转化子总,数的,50-80%,3,、用于转化子筛选的标记基因,用于酵母菌转化子筛选的标记基因主要有,营养缺陷型互补基因,和,显性基因,两大类,营养缺陷型互补基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：,LEU,、,TRP,、,HIS,、,LYS,、,URA,、,ADE,但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非常困难,营养缺陷型的互补基因,3,、用于转化子筛选的标记基因,显性标记基因的编码产物只要是毒性物质的抗性蛋白,显性标记基因,aph,氨基糖苷转移酶 抗,G418,cat,氯霉素乙酰转移酶 抗氯霉素,dhfr,二氢叶酸还原酶 抗氨甲喋呤和磺胺,cup1,铜离子螯合物 耐受铜离子,suc2,蔗糖转化酶 耐受高浓度蔗糖,ilv2,乙酰乳糖合成酶 抗硫酰脲除草剂,标记基因,编码产物,遗传表型,五、,酵母菌的表达系统,2,、外源基因在酵母菌中表达的限制因素,1,、酵母菌启动子的可控性,3,、酵母菌表达系统的选择,第十五章,酵母基因工程,1,、酵母菌启动子的可控性,pho4,TS,-PHO5,启动子：,酿酒酵母,PHO5,启动子在培养基中游离磷酸盐耗尽时才能打开,PHO4,基因编码产物是,PHO5,启动子的正调控因子,因此，装在,pho4,TS,-PHO5,启动子下游的外源基因在,35,时关闭,23,诱导表达,（,1,）温度控制型启动子,PHO4,温度敏感型突变基因,pho4,TS,的编码产物在35,时失活,1,、酵母菌启动子的可控性,a,a,型启动子：,酿酒酵母有,a,和,a,两种单倍体，分别由,MAT,a,和,MAT,a,两个等位基因决定。,a,1,因子决定,a,细胞特征表达,a,2,因子阻遏,a,细胞,特征表达,a1-a2,阻遏,a,细胞特征表达,编码,a,2,因子的基因突变型,hml,a,2-102,能产生,a,2,变体,，它能灭活,a1,，,同时阻遏,a,型,温度控制型启动子,a,型启动子,hml,a,2-102,MATa,a1,Sir3-8,TS,a,型启动子,受体细胞基因组 重组质粒,a,型启动子,hml,a,2-102,MATa,a1,Sir3-8,TS,a,型启动子,a,2,a,1,25,35,1,、酵母菌启动子的可控性,酿酒酵母,（,2,）超诱导型启动子,GAL1,GAL7,GAL10,UAS,GAL4,GAL80,半乳糖诱导效果不明显，基因基底水平表达,GAL1,GAL7,GAL10,UAS,GAL4,GAL80,半乳糖诱导时，,GAL4,高效表达，,GAL1,、,GAL1,、,GAL10,超高效表达,GAL10,Promoter,的半乳糖,利用酶系,由,GAL1,GAL7,和,GAL10,基因编码,2,、外源基因在酵母菌中表达的限