总糖和还原糖的测定及葡萄糖标准曲线的绘制-3,5-二硝基水杨酸法

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验一、,总糖和还原糖的测定,3,5-,二硝基水杨酸法,一、实验目的,1,、掌握还原糖和总糖测定的基本原理；,2,、学习用,3,5-,二硝基水杨酸法测定还原糖的方法。,二、实验原理,还原糖是指含有自由醛基或者酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖；利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来；对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。,还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，,3,5-,二硝基水杨酸则被还原为棕红色的,3-,氨基,-5-,硝基水杨酸。,NaOH,黄色,棕红色,加热,在过量的,NaOH,碱性溶液中，,3-,氨基,-5-,硝基水杨酸呈橘红色，在,540nm,处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值成线性关系。利用比色法，在,540nm,波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。,三、实验器材,1,、材料：山芋粉,2,、仪器：电子分析天平、水浴锅、,V-1100,可见分光光度计、移液器,3,、其他：试管、容量瓶、三角烧瓶、量筒、吸管（移液管）、洗耳球、玻棒、洗瓶、漏斗、离心管、六凹反应盘、,pH,试纸（,1,14,）,四、实验试剂,1,、标准葡萄糖溶液（,1.0mg/ml,）,2,、,DNS,试剂,3,、,6mol/L,HCl,4,、,6mol/L,NaOH,5,、,I,2,-KI,溶液,五、操作,1,、样品中还原糖的提取,准确称取,0.5g,山芋粉置于,100ml,三角烧瓶中,加,3ml,蒸馏水，调成糊状,再加,30ml,蒸馏水,50,水浴，,30min(,不时搅拌,),转移至,50ml,离心管中，,4000rpm,，,5min,上清液,1,沉淀,加,20ml,蒸馏水，洗涤沉淀，,4000rpm,，,5min,上清液,2,沉淀,(,弃,),置于容量瓶中，蒸馏水定容至,100ml,混匀，取,1ml,即可进行还原糖的测定。,2,、样品中总糖的水解、提取,准确称取,0.2g,山芋粉置于,100ml,三角烧瓶中,加,3ml,蒸馏水，调成糊状,再加,12ml,蒸馏水，,5ml 6mol/L,HCl,沸水浴，,30min(,不时搅拌,),取,1,2,滴于六凹反应盘中，加,1,滴,I,2,-KI,溶液，如果完全不显蓝色，即可进行下面的操作。,冷却至室温,用,6mol/L,NaOH,调,pH7.0,（,pH,试纸）,蒸馏水定容至,100ml,混匀,滤纸过滤，取,10ml,滤液用蒸馏水定容至,100ml,，成稀释,1000,倍的总糖水解液，混匀,取,1ml,总糖水解液，测定其还原糖的含量,3,、,制作葡萄糖标准曲线及还原糖、总糖含量的测定。,取,8,支洁净的试管，分别用记号笔标上,0,7,号，按照下表进行操作。其中,0,5,管，用于标准曲线的制作,以吸光度为纵坐标，各标准液浓度（,mg/ml,）为横坐标作图得标准曲线（用,Excel,表制作）。,管号,试剂,0,1,2,3,4,5,6,7,标准葡萄糖溶液,/ml,0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.0,1.0,蒸馏水,/ml,1.0,0.8,0.6,0.4,0.2,0,0,0,DNS,试剂,/ml,2.0,2.0,2.0,2.0,2.0,2.0,2.0,2.0,沸水浴中准确煮沸,5min,，取出，用自来水冷却至室温,蒸馏水,/ml,9.0,9.0,9.0,9.0,9.0,9.0,9.0,9.0,葡萄糖含量,/mg,0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,C1,C2,A,540nm,a,b,六、计算,C,1,V,1,(,还原糖,)=100%,m,1,C,2,V,2,(,总糖,)=,0.9,100%,m,2,附：相关仪器使用,1,、移液管的使用,2,、移液器的使用,3,、离心机的使用,注意配平，对称放,4,、,V-1100,可见分光光度计的使用,比色皿,V-1100,可见分光光度计,开机预热,30min,测吸光度 选择波长（,540nm,）,MODE,键切换到,T,，将黑体放入光路中,合上盖，,0,键校零,MODE,键切换到,A,，参比液放入到光路中,合上盖，,100,键调零,将待测液依次放入到光路中，即可得出待测液的吸光度。,比色皿的使用,